ฤทธิ์ทางชีวภาพของโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาว

Abstract

Currently, stress, pollution and ultraviolet radiation (UVR) affects the reactive oxygen species (ROS). The ROS also contributes to the incidences of hyperpigmentation and skin aging such as dark spots, blotches or melasma, wrinkles and sunburn. Melanin is mainly synthesized by tyrosinase (polyphenol oxidase) through the monophenolase and di-phenolase reactions. Overactivity of the tyrosinase by ROS leads to hyperpigmentation. The ROS also activates collagenase or matrix. metalloproteinase-1 (MMP-1), which effect collagen and elastic fibers degradation causing wrinkles and skin aging. Therefore, multiple inhibitors such as kojic acid, ascorbic acid, and arbutin are added as ingredients in creams and skin care lotions to reduce those skin problems. These chemical products have a strong therapeutic effect, however, using them in large amount may affect in skin sensitivity (dermatitis) or irritation. Nowadays, bioactive peptides, protein hydrolysates, are popularly used cosmetic in products which inhibit tyrosinase activity, antioxidant and some peptides decrease the collagen degradation. In this study, biological activities of protein hydrolysate from Lentinus squarrosulus Mont. protein hydrolysate were reported. In tyrosinase inhibition experiments, the fresh Lentinus squarrosulus protein hydrolysate (FPH) (IC50 2.747 µg/µL) was more effectiveness in tyrosinase inhibitory than dried Lentinus squarrosulus protein hydrolysate (DPH). The tyrosinase inhibitory effect was similar to synthetic peptide (RHAKF) (IC50 3.086 µg/µL). For collagenase inhibition assay, the FPH can inhibit collagenase (MMP-1) better than DPH. The half maximal inhibitory concentration of FPH and DPH was 3.205 µg/µL and 4.166 µg/µL, respectively that was similar to 1,10-phenanthroline and synthetic peptide GFSGLDGAKGD. The antioxidant activitiy of FPH was similar to DPH by ABTS at IC50 2.632 and 2.631 µg/µL respectively. The free radical scavenging activity by DPPH assay, the FPH showed stronger than DPH by IC50 at 3.13 and 4.17 µg/µL, respectively. The cytotoxicity using MTT assay, both FPH and DPH are not toxicity using HaCaT cell. The peptides from protein hydrolysates of FPH and DPH were identified by LC-MS/MS, four peptides were selected by tyrosinase and collagenase docking. The selected tyrosinase peptides of FPH and DPH are; LILGGSSS and LLLKPKVLL, respectively. After chopping and docking the two peptides by GOLD fitness score (2Y9X; Tyrosinase), the highest score for 2Y9X were SSS and LLLK at 72.70 and 76.67 respectively. For collagenase docking using PLP fitness score (1CGL; collagenase), RLRTLLLLLFLM and LIPLLKLLRVV were selected with highest score at 146.10 and 134.00 respectively. Another two peptides, LILLPLKP and LLLKPKVL were also selected with highest free-radical scavenging (FRS) score at 0.43 and 0.47 respectively. In conclusion, the fresh Lentinus squarrosulus protein hydrolyzed with pepsin was stronger bioactivities than crude protein and showed non-toxicity. The peptides/protein hydrolysate derived from Lentinus squarrosulus could be valuable sources to decrease hyperpigmentation and skin aging for skincare or food supplement in further studies.

ในปัจจุบันภาวะเครียด มลภาวะ รวมทั้งการได้รับรังสีอัลตราไวโอเลตทำให้กระตุ้นการเกิดอนุมูลอิสระและภาวะการสังเคราะห์เม็ดสีเมลานินมากเกินไป (Hyperpigmentation) เช่นการเกิดฝ้า กระ รวมทั้งภาวะ photo aging หรือริ้วรอยก่อนวัย การกระตุ้นให้เกิดกระบวนการสังเคราะห์เม็ดสีเมลานิน มีเอนไซม์สำคัญที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยา คือ เอนไซม์ไทโรซิเนส (tyrosinase) ผ่านปฏิกิริยา monophenolase และ diphenolase นอกจากนี้สารอนุมูลอิสระยังกระตุ้นการทำงานของ เอนไซม์คอลลาจีเนส หรือ Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) ซึ่งย่อยสลาย คอลลาเจน และ elastic fibers ก่อให้เกิดริ้วรอย และการชราของผิว ในทางเวชสำอางนิยมนำ วิตามินซี กรดโคจิกและอาร์บูติน ใช้ลดปัญหาภาวะดังกล่าว อย่างไรก็ตามหากมีการใช้ต่อเนื่อง อาจเกิดผลข้างเคียงต่อผิวหนัง ปัจจุบันสารสกัดเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพจากอาหารถูกนำมาใช้ในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง ซึ่งปลอดภัยต่อผู้ใช้ ผู้วิจัยจึงสนใจศึกษาการเตรียมโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวแห้งและเห็ดขอนขาวสดต่อฤทธิ์ทางชีวภาพ พบว่าโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวสด สามารถออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสได้สูงกว่าโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวแห้งและกรดโคจิกมีค่า IC50 เท่ากับ 2.747 µg/µL และมีฤทธิ์ใกล้เคียงกับเปปไทด์สังเคราะห์ RHAKF ที่มีค่า IC50 เท่ากับ 3.086 µg/µL เมื่อทดสอบการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์คอลลาจีเนส โปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวสด มีค่า IC50 เท่ากับ 3.205 µg/µL ซึ่งมีฤทธิ์สูงกว่าโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวแห้งที่มีค่า IC50 เท่ากับ 4.166 µg/µL และมีฤทธิ์ใกล้เคียงกับ 1,10-phenanthroline และ เปปไทด์สังเคราะห์ GFSGLDGAKGD เมื่อทำการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระพบว่าฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจากเห็ดขอนขาวแห้งและสดด้วยวิธี ABTS มีค่า IC50 อยู่ที่ 2.631 และ 2.632 µg/µL ตามลำดับ ในขณะที่ทดสอบด้วยวิธี DPPH จะมีค่า IC50 เท่ากับ 4.17 และ 3.13 µg/µL ตามลำดับ การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ด้วยวิธี MTT พบว่าโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวแห้งและเห็ดขอนขาวสดไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ผิวหนัง HaCaT เมื่อทำการวิเคราะห์ลำดับเปปไทด์จากโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ ด้วยวิธี LC-MS/MS ได้ทำการคัดเลือกเปปไทด์ที่น่าสนใจ 4 ลำดับจากตัวอย่างสารสกัดเปปไทด์จากเห็ดขอนขาวสดและเห็ดขอนขาวแห้งในการจำลองการจับกับเอนไซม์ไทโรซิเนส ได้แก่ลำดับที่ 1 คือ LILGGSSS และ ลำดับที่ 2 LLLKPKVLL มีค่า GOLD fitness score ของการจำลองการจับกันกับเอนไซม์ไทโรซิเนส (2Y9X) แบบ 3 มิติกับลำดับเปปไทด์ภายในสายคือลำดับ SSS เท่ากับ 72.70 และ LLLK มีเท่ากับ 76.67 และการจำลองการจับกับเอนไซม์คอลลาจีเนสในส่วนลำดับที่ 3 RLRTLLLLLFLM และลำดับที่ 4 LIPLLKLLRVV มีค่าพลังงานจากการจับกันกับเอนไซม์คอลลาจีเนส (1CGL) แบบ 3 มิติ มีค่า PLP fitness score เท่ากับ 146.10 และ 134.00 และ อีกสองลำดับเปปไทด์ คือ LILLPLKP และ LLLKPKVL จากการวิเคราะห์จากค่า Free-radical scavenging (FRS) สูงที่สุดเมื่อเทียบกับลำดับอื่นภายในกลุ่มสายลำดับเปปไทด์ เท่ากับ 0.43 และ 0.47 ตามลำดับจากการศึกษาสารสกัดโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดขอนขาวสดที่ย่อยด้วยเอนไซม์เปปซินนี้สามารถให้ฤทธิ์ทางชีวภาพมากกว่าสารสกัดโปรตีนจากเห็ดขอนขาวที่ไม่ได้ผ่านการย่อยสลาย ดังนั้นจึงเป็นแหล่งโปรตีนหรือเปปไทด์ชนิดใหม่เพิ่มมูลค่าค่าให้แก่วัตถุดิบ เพื่อประยุกต์เป็นผลิตภัณฑ์บำรุงผิวเพื่อลดการเกิดริ้วรอยแก่ชรา จุดด่างดำ ฝ้า กระ และความหมองคล้ำต่อไป