การพัฒนาเทคนิค loop-mediated isothermal amplification (LAMP) เพื่อตรวจหาเชื้อ Colletotrichum asianum ที่ก่อโรคแอนแทรกโนส

Abstract

Anthracnose is a plant disease causing severe post-harvest damage to agricultural products. It is mainly caused by fungi of the genus Colletotrichum, which can infect plants at any growth stage. In particular, it can infect in a latent stage, where symptoms do not show on immature fruits but become severe when the fruit ripens. This result, makes it undesirable to consumers, shortening its shelf life, and hindering exportation. Therefore, this research aimed to develop technique called a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for anthracnose disease caused by C. asianum. The fruits of mango, guava, dragon fruit and banana showing symptoms from markets around the Naresuan University were collected and cultured using tissue transplant technique. The results showed that 11 fungal isolates were divided into 3 groups according to morphological characteristics such as color of mycelium and the shape of conidia. The ITS sequences identified the fungal samples as five species: three species of Colletotrichum (C. musae, C. fructicola, and C. asianum), and two other genera, Fusarium incarnatum and Pestalotiopsis sydowiana. Phylogenetic analysis indicated that C. asianum is most closely related to C. fructicola. The development of the LAMP technique for anthracnose disease detection showed that C. asianum and C. musae could be detected at a constant temperature of 65 degrees Celsius in 45 minutes. The detection sensitivity for C. asianum was achieved at a minimum DNA concentration of 1 ng/μL, while for C. musae it was 25 ng/μL. Compared to the PCR technique, the LAMP technique was found to be up to 10 times faster in detection sensitivity. Therefore, the LAMP technique is efficient for rapidly detecting anthracnose disease, enabling effective disease control and reducing post-harvest losses, including those during exportation.

โรคแอนแทรกโนสเป็นโรคพืชที่ก่อให้เกิดความเสียหายหลังการเก็บเกี่ยวผลผลิตทางการเกษตรเป็นอย่างมาก สาเหตุหลักมาจากเชื้อราสกุล Colletotrichum โดยจะเข้าทำลายพืชได้ทุกระยะการเติบโต โดยเฉพาะการเข้าทำลายแบบแฝง ซึ่งไม่แสดงอาการของโรคให้เห็นในช่วงผลอ่อนแต่จะแสดงอาการรุนแรงออกมาในช่วงผลสุก ทำให้ผลผลิตเน่าเสียไม่เป็นที่ต้องการของผู้บริโภค อายุการเก็บรักษาสั้น และไม่สามารถขนส่งระยะไกลได้ ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์พัฒนาเทคนิค Loop–Mediated Isothermal Amplification (LAMP) ในการตรวจหาเชื้อรา C. asianum ที่ก่อโรคแอนแทรกโนส โดยเก็บตัวอย่างผลไม้ที่พบรอยโรคจากตลาดสดรอบมหาวิทยาลัยนเรศวรมา 4 ชนิดคือ มะม่วงน้ำดอกไม้ ฝรั่ง แก้วมังกร และกล้วยหอม จากนั้นแยกเชื้อราให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี tissue transplant ผลการศึกษา พบว่าสามารถแยกเชื้อราที่พบทั้งหมด 11 ไอโซเลต ซึ่งแบ่งออกได้ 3 กลุ่มจากสีของเส้นใยและลักษณะของโคนิเดีย และจากข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ ITS สามารถจำแนกเชื้อราได้ทั้งหมด 5 ชนิด โดยเป็นเชื้อราในสกุล Colletotrichum จำนวน 3 ชนิด ได้แก่ C. musae, C. fructicola และ C. asianum และเชื้อราสกุลอื่นอีก 2 ชนิด คือ Fusarium incarnatum และ Pestalotiopsis sydowina และเมื่อนำข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ ITS มาวิเคราะห์หาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม พบว่าเชื้อรา C. asianum และ C. fructicola มีความใกล้ชิดทางพันธุกรรมกันมากที่สุด ผลการพัฒนาเทคนิคแลมป์สำหรับตรวจหาเชื้อราก่อโรคแอนแทรกโนส พบว่าสามารถตรวจพบเชื้อรา C. asianum และ C. musae ได้ที่อุณหภูมิคงที่ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที ซึ่งประสิทธิภาพความไวในการตรวจหาเชื้อรา C. asianum สามารถตรวจพบได้ที่ความเข้มข้นต่ำสุดของดีเอ็นเอที่ 1 นาโนกรัม/ไมโครลิตร ในขณะที่ประสิทธิภาพความไวในการตรวจหาเชื้อรา C. musae สามารถตรวจพบได้ที่ความเข้มข้นต่ำสุดของดีเอ็นเอที่ 25 นาโนกรัม/ไมโครลิตร เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิคพีซีอาร์ พบว่าเทคนิคแลมป์มีประสิทธิภาพความไวในการตรวจจับเชื้อได้ไวกว่าถึง 10 เท่า ดังนั้นเทคนิคแลมป์จึงมีประสิทธิภาพในการตรวจพบเชื้อราก่อโรคแอนแทรกโนสในพืชได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งช่วยให้เกิดการควบคุมโรคในผลผลิตได้อย่างมีประสิทธิภาพส่งผลให้ลดการสูญเสียผลผลิตในระหว่างเก็บเกี่ยวรวมไปถึงระว่างการส่งออกอีกด้วย