ฤทธิ์การยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสของดอกเห็ดหอมและดอกเห็ดเป่าฮื้อที่ผ่านการย่อยโดยเอนไซม์ย่อยโปรตีน

Abstract

Melanin is a pigment which is produced from the melanocyte cells by the process called melanogenesis. Tyrosinase is a key enzyme in the melanin production, and its over activity leads to dermatological disorders (hyperpigmentation). Generally, a depigmenting agent may consist of ascorbic acid, arbutin and kojic acid, and many others that are used in cosmetic products to reduce free radicals and melanin synthesis. These substances when used for a long period of time may accumulate in large quantities in the skin, which can result in cytotoxic damage to the melanocyte cells. A discovery of new depigmentation compounds from natural products such as peptides, are able to inhibit tyrosinase activity which may help to reduce the side effects on the skin cells. In this study, the protein hydrolysate (PH) was prepared from fruiting body of Horm (Lentinus edodes) and the Paohue (Pleurotus cystidiosus) mushrooms. These samples were divided into 4 groups based on enzymatic digestion to obtain peptides that were smaller than 3 kDa in each of the groups: (1) fresh L. edodes hydrolyzed with a mixed enzymes (FHm), (2) fresh L. edodes hydrolyzed only with pepsin (FHp), (3) dried L. edodes hydrolyzed with a mixed enzymes (DHm), (4) Fresh P. cystidiosus hydrolyzed only with pepsin (FPp). After the hydrolysis reaction was performed for 24 h, the protein hydrolysates were partially purified using ultrafiltration of MwCO at 10 and 3 kDa. The protein hydrolysates showed molecular weight size of less than 6.5 kDa by Tricine–SDS PAGE. The degree of hydrolysis was determined by using the TNBS method, while the protein hydrolysates that used the mixed enzymes, showed a higher degree of hydrolysis (%DH) than only using the pepsin (87% DHm and 86% FHm). From the total phenolic compound content assay, DHm also had the highest content of phenolic compounds and antioxidant activity compared to the other protein hydrolysates (IC50 DPPH 1.260 µg/µL and ABTS 0.605 µg/µL). Interestingly, the FPp contained less phenolic compounds and lower free radical antioxidant activity, but had the highest tyrosinase inhibitory activity (IC50: 0.071 µg/µL) and its inhibitory ability showed no statistical difference when compared to RHAKF (IC50: 0.690 µg/µL) and kojic acid (IC50: 0.047 µg/µL), respectively. The inhibitory kinetics of FPp was a non-competitive inhibition. This should be concluded that pepsin hydrolysis of the mushroom proteins was effective for inhibiting tyrosinase, while the mixed enzymes may help with antioxidant activity. The cytotoxicity of protein hydrolysate was performed using the MTT assay. It was also found that the protein hydrolysate prepared from FHm, FHp and FPp fresh mushrooms that have nontoxic to normal human keratinocyte cells (HaCaT cell), while the DHm from a dried mushroom was toxic to HaCaT cells at concentrations of more than 1 mg/mL. Amino acid sequencing by LC-MS technic analysis revealed 5 interesting peptide sequences, which were, (1) PATVSIPGV, (2) LTLEEGESVG and (3) LGERTLDEI that are of interest in the study of tyrosinase inhibition, and (4) SVTPATIPPY and (5) VGGLPGGG were also of interest in the study of antioxidant activity (free-radical scavenging of 0.4042 and 0.5230, respectively). The Molecular docking simulation results showed that the binding of the protein tyrosinase and the ligands were, IPGV (PATVSIPGV), TLEE (LTLEEGESVG) and LGER (LGERTLDEI) which had binding energy values of 59.92, 79.07 and 75.39, respectively. This showed that the TLEE ligand had the highest binding capability to the active site of tyrosinase. The researchers assumed that these peptides also promoted the intracellular tyrosinase inhibitory effect. To precisely identify the mushroom strains, DNA barcoding based on the Internal transcribed spacer (ITS) region was performed. The sequence identities of shiitake (L. edodes) were higher than 99% which was similar to the L. edodes strain CC7 (MK940837), while the sequence identities of abalone (P. cystidiosus) were similar to the P. cystidosus isolate XH004 small subunit ribosomal RNA gene (MW947478.1), P. cystidosus isolate XH006 small subunit ribosomal RNA gene (MW947480.1), P. cystidosus isolate XH008 small subunit ribosomal RNA gene (MW947482.1), P. cystidosus var. formosensis CBS 100129 (NR103594.1), P. cystidosus stain S396 clone B 18S ribosomal RNA gene (DQ882573.1), CGMCC 3.7470 small subunit ribosomal RNA gene (KX787086.1), and Blao clone B 18S ribosomal RNA gene (DQ882571.1) were higher than 94%, respectively.

เมลานินเป็นเม็ดสีที่สร้างมาจากเมลาโนไซต์ผ่านกระบวนการเมลาโนเจนนิสิส โดยมีเอนไซม์ไทโรซิเนสเป็นกุญแจสำคัญเร่งปฏิกิริยาของกระบวนการ หากมีการทำงานของเอนไซม์ชนิดนี้มากเกินไปจะส่งผลให้เกิดความผิดปกติทางผิวหนัง (hyperpigmentation) ปัจจุบันทางเวชสำอางใช้วิตามินซี อาร์บูติน และ กรดโคจิก ฯลฯ มาเป็นองค์ประกอบผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสหรือลดสารอนุมูลอิสระในการลดการสร้างเม็ดสีเมลานิน แต่อย่างไรก็ตามสารกลุ่มดังกล่าวหากใช้ในระยะยาวและเกิดสะสมในปริมาณมาก อาจทำให้เกิดผลข้างเคียงต่อเซลล์ผิวหนังได้ ดังนั้นปัจจุบันมีการใช้สารสกัดจากธรรมชาติเช่นกลุ่มเปปไทด์เพื่อลดการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสจึงเป็นทางเลือกหนึ่งที่อาจส่งผลข้างเคียงต่อเซลล์ผิวหนังที่น้อยกว่า ในการศึกษานี้ผู้วิจัยสนใจในการศึกษาการเตรียมโปรตีนไฮโดรไลเสท (PH) ด้วยเอนไซม์โปรติเอสเพื่อให้ได้เปปไทด์ที่มีขนาดเล็กกว่า 3 kDa จากดอกเห็ดต่อการออกฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสและต้านอนุมูลอิสระ โดยการทดลองแบ่งตัวอย่างเป็น 4 กลุ่ม ได้แก่ เห็ดหอมสดที่ย่อยด้วยมิกส์เอนไซม์ (FHm) เห็ดหอมสดที่ย่อยด้วยเอนไซม์เปปซิน (FHp) เห็ดหอมแห้งที่ย่อยด้วยมิกส์เอนไซม์ (DHm) และเห็ดเป่าฮื้อสดที่ย่อยด้วยเอนไซม์เปปซิน (FPp) สารสกัดทั้งหมดถูกย่อยเป็นเวลา 24 ชั่วโมง นำมาตรวจสอบขนาด Tricine (SDS-PAGE) และวัดระดับการย่อยสลาย (%DH) พบว่าเปปไทด์มีขนาดเล็กกว่า 6.5 kDa โดยสารสกัดโปรตีนไฮโดรไลเสทที่ผ่านการย่อยโดยใช้มิกส์เอนไซม์มีค่าระดับการย่อยสลายสูงกว่าการใช้เอนไซม์เปปซินเพียงชนิดเดียว (DHm 87% และ FHm 86%) ทั้งยังพบว่า DHm มีปริมาณสารประกอบฟินอลิกและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงที่สุดเมื่อเทียบกับสารสกัดอื่น (IC50 DPPH 1.260 และ ABTS 0.605 µg/µL) ในขณะที่ FPp มีสารประกอบฟินอลิกและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระต่ำ แต่มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสสูงที่สุด (IC50 Tyrosinase inhibition 0.071 µg/µL) ซึ่งไม่แตกต่างกันทางสถิติเมื่อเทียบกับ 1.5 µg/µL ของ RHAKF (IC50 0.690 µg/µL) และ 0.1 µg/µL ของกรดโคจิก (IC50 0.047 µg/µL) ตามลำดับ และ FPp มีกลไกการยับยั้งชนิดไม่แข่งขัน หรือ (noncompetitive) โดยผลสรุปได้ว่าการย่อยโปรตีนด้วยเอนไซม์เปปซินมีประสิทธิภาพเหมาะสำหรับการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส ในขณะที่การย่อยด้วยมิกส์เอนไซม์อาจช่วยเรื่องต้านอนุมูลอิสระได้ ทั้งยังพบว่าสารสกัดโปรตีนไฮโดรไลเสทจากเห็ดสดทั้ง FHm, FHp และ FPp มีอัตราการรอดชีวิตของเซลล์เมื่อทดสอบด้วยวิธี MTT ในทางตรงข้ามเห็ดหอมแห้งที่ย่อยด้วยมิกส์เอนไซม์ (DHm) มีความเป็นพิษต่อเซลล์ HaCaT ที่ระดับความเข้มข้น 1 mg/mL เป็นต้นไป ผลวิเคราะห์หาลำดับกรดอะมิโน (LC-MS) พบลำดับเปปไทด์ที่สนใจ 5 สาย ได้แก่ (1) PATVSIPGV, (2) LTLEEGESVG และ (3) LGERTLDEI เป็นลำดับที่มีความน่าสนใจต่อการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส ในขณะที่ (4) SVTPATIPPY และ (5) VGGLPGGG เป็นลำดับที่มีความน่าสนใจต่อการศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (Free-radical scavenging 0.4042 และ 0.5230 ตามลำดับ) ผลการจำลองการจับกันผ่านเทคนิค Molecular docking พบว่าการจับกันของเอนไซม์ไทโรซิเนสและลิแกนด์ IPGV (PATVSIPGV), TLEE (LTLEEGESVG) และ LGER (LGERTLDEI) มีค่าพลังงานจากการจับกันของสาร (binding energy) เท่ากับ 59.92, 79.07 และ 75.39 ตามลำดับ และจับด้วยพันธะไฮโดรเจนเป็นหลัก ซึ่งชี้ให้เห็นว่า TLEE มีการจับกับเอนไซม์ไทโรซิเนสที่ดีที่สุด ผู้วิจัยคาดว่าเปปไทด์เหล่านี้ที่ส่งเสริมการออกฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสในเซลล์ได้ดีเช่นกัน และผลการทดลองการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์เครื่องหมายดีเอ็นเอแบบบาร์โค้ดโดยใช้ ITS region สามารถจำแนกสายพันธุ์ดอกเห็ด โดยระบุความเหมือน (identity) ชนิดของเห็ดหอม (L. edodes) ได้คล้ายคลึงกับสายพันธุ์ CC7 (MK940837) มากกว่าร้อยละ 99 ในขณะที่ความเหมือน (identity) ชนิดของเห็ดเป่าฮื้อ (P. cystidiosus) ได้คล้ายคลึงกับ P. cystidosus isolate XH004 small subunit ribosomal RNA gene (MW947478.1), P. cystidosus isolate XH006 small subunit ribosomal RNA gene (MW947480.1), P. cystidosus isolate XH008 small subunit ribosomal RNA gene (MW947482.1), P. cystidosus var. formosensis CBS 100129 (NR103594.1), P. cystidosus สายพันธุ์ S396 clone B 18S ribosomal RNA gene (DQ882573.1), CGMCC 3.7470 small subunit ribosomal RNA gene (KX787086.1) และ Blao clone B 18S ribosomal RNA gene (DQ882571.1) มากกว่าร้อยละ 94 ตามลำดับ