การแยกและศึกษาคุณสมบัติของแบคทีเรียที่มีศักยภาพในการย่อยโพลีไซคลิกอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอนและพลาสติกจากบริเวณที่มีการปนเปื้อน

Abstract

Contaminations of plastic wastes and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in environments are pollution issues for community health. Some bacteria colonized in environments have capabilities to use plastic or PAHs as carbon sources to produce energy and survive. Bacterial bioremediations of these pollutants are applicable. Therefore, purposes of this study are to isolate and characterize bacteria that show ability to degrade plastic (Polycaprolactone) or PAHs (Naphthalene) from soil samples contaminated with plastic waste or in agricultural areas in Uttaradit and Phitsanulok provinces. This study collected 62 soil samples. No bacteria were isolated and able to degrade Polycaprolactone. However, PAHs-degradation screening in agar supplemented with Naphthalene at 200 µg/ml revealed that 36 bacterial isolates were detected from 36 soil samples. We also determined the lowest concentration (Minimum Inhibitory Concentrations of Naphthalene; MICNap) that inhibit the growth of these 36 isolates. The detected MICNap were ranged from 400 to 6,400 µg/ml. Only 14 isolates that showed highest MICNap were selected for the next experiment. Among selected isolates, all of them were gram-negative and showed the same biochemical profiles. By considering results of microbiological characteristics, we randomly chosen 7 representative isolates for genus identification by Sanger sequencing of amplified 16S rDNA. Sequence analysis against bacteria from databases and ATCC type strains demonstrated that 6 isolates were found to be klebsialla spp. and remaining isolate was identified as Enterobacter spp. Next, we examined the survival rate of 7 isolates in the presence of MICNap and found all isolates could not survive. ERIC-PCR-based genotyping revealed genetic diversity among studied bacterial isolates. In addition, susceptibility to six classes of antibiotics were determined. Most of isolates were found sensitive to all tested antibiotic, except for one isolate which was resistant to tetracycline. In conclusion, this study demonstrated that bacterial isolates obtained from soil sample in Uttaradit and Phitsanulok provinces were able to degrade and tolerate to high concentrations of Naphthalene. High genetic diversity anomg these isolates were found. However, these chosen isolates were classified into two genus that might be pathogens and some of them was able to resist to some antibiotic. For further bioremediation applications, genomic analysis of genetic elements involved in antibiotic resistance, pathogenicity, and PAHs utilizations is important to conduct.

พลาสติกและสารประกอบโพลีไซคลิกอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs) มีการปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมและเป็นปัญหาต่อสุขภาวะชุมชน จุลินทรีย์บางชนิดในสิ่งแวดล้อมสามารถใช้พลาสติกหรือสารประกอบโพลีไซคลิกอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน เป็นแหล่งคาร์บอนและพลังงานในการเจริญเติบโต จึงมีการประยุกต์ใช้จุลินทรีย์ในการบำบัดสารปนเปื้อนดังกล่าว ดังนั้นการศึกษาครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดแยกแบคทีเรียที่สามารถการย่อยพลาสติกหรือ PAHs รวมถึงศึกษาคุณสมบัติทางจุลชีววิทยา และคุณสมบัติต่างๆ โดยในการศึกษาครั้งนี้ทำการเก็บและคัดแยกเชื้อแบคทีเรียจากตัวอย่างดินบริเวณที่ปนเปื้อนขยะพลาสติกหรือบริเวณพื้นที่ทำเกษตรกรรมจากจังหวัดอุตรดิตถ์และจังหวัดพิษณุโลก ทั้งหมด 62 ตัวอย่าง โดยไม่พบแบคทีเรียที่สามารถย่อยพลาสติก (Polycaprolactone) อย่างไรก็ตามจาการคัดกรองแบคทีเรียย่อย PAHs บนอาหารที่ผสม Naphthalene ที่ความเข้มข้น 200 µg/ml พบว่ามีแบคทีเรียจากตัวอย่างดิน 36 ตัวอย่าง ที่สามารถย่อยและเจริญบนอาหารที่ผสม Naphthalene ได้ จากนั้นนำแบคทีเรียทั้ง 36 ไอโซเลตมาศึกษาระดับความเข้มข้นน้อยที่สุดของ Naphthalene ที่สามารถยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแต่ละไอโซเลตได้ (Minimum Inhibitory Concentrations of Naphthalene; MICNap) โดยพบว่าเชื้อที่ทดสอบมีค่า MICNap ตั้งแต่ 400 µg/ml ถึงสูงสุด 6,400 µg/ml ซึ่งเราได้นำเชื้อที่มีค่า MICNap สูงสุดจำนวนทั้งหมด 14 ไอโซเลตมาศึกษาคุณสมบัติทางจุลชีววิทยา โดยพบว่าเชื้อทั้งหมดเป็นแกรมลบและมีรูปแบบผลการทดสอบทางชีวเคมีคล้ายกัน เราจึงสุ่มคัดเลือกเชื้อจำนวน 7 ไอโซเลตมาระบุจีนัสด้วยการหาลำดับเบสของยีน 16s rDNA โดยเทคนิค Sanger sequencing จากการเทียบลำดับเบสกับเชื้อในฐานข้อมูลและเชื้อสายพันธุ์อ้างอิง (ATCC type strains) พบว่าแบคทีเรียที่ศึกษาจัดเป็นจีนัส klebsiella spp. จำนวน 6 ไอโซเลตและ Enterobacter spp. จำนวน 1 ไอโซเลต จากนั้นทำการศึกษาคุณสมบัติอื่นๆ เช่นอัตราการอยู่รอด ที่ระดับ MICNap พบว่าเชื้อทั้งหมดไม่สามารถเจริญได้ในระดับความเข้มข้น MICNap การศึกษาลักษณะทางจีโนไทป์ด้วยเทคนิค ERIC-PCR พบว่าเชื้อมีความหลากหลายทางจีโนไทป์ นอกจากนั้นยังทดสอบความไวต่อย่าปฏิชีวนะจำนวนหกกลุ่มยาปฏิชีวนะ พบว่าเชื้อทั้งหมดไวต่อยาปฏิชีวนะทุกตัวที่ทดสอบ มีเพียงแบคทีเรียไอโซเลตเดียวที่ดื้อต่อยา Tetracycline จากการศึกษาครั้งนี้พบแบคทีเรียที่สามารถย่อย PAHs จากตัวอย่างดินของจังหวัดอุตรดิตถ์และจังหวัดพิษณุโลก โดยพบว่าเชื้อที่แยกได้สามารถทนต่อ Naphthalene ที่ความเข้มข้นสูงได้และมีความหลากหลายของจีโนไทป์ แต่อย่างไรก็ตามเชื้อทั้งหมดจัดอยู่ในจีนัสที่อาจจะก่อโรคในสัตว์และมนุษย์ได้ ทั้งยังพบการดื้อยาปฏิชีวนะบางชนิด เพราะฉะนั้นการศึกษาในระดับจีโนมเพื่อตรวจหายีนที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยาปฏิชีวนะและความรุนแรงในการก่อโรค รวมถึงการย่อยสลาย PAHs จึงมีความจำเป็น ก่อนการนำแบคทีเรียไอโซเลตต่างๆไปประยุกต์ใช้เพื่อการบำบัดในอนาคตต่อไป