การตรวจสอบวิเคราะห์ชนิดการกลายพันธุ์ของฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดแอลฟาด้วยเทคนิค High resolution melting (HRM) analysis

Abstract

Alpha Hemoglobin (Hb) variants are one of the common gene disorders that found in Thailand, a number of Hb analyses and identification of Hb variants in Thai population have been increasingly encountered but most of them cannot be diagnosed in routine setting. Accurate diagnoses of these variants are important for planning of appropriate management and genetic counseling for the patients and their family. However, this inconclusive phenotypic result requires verification using DNA analysis. The aim of this study, we developed real-time PCR technique with HRM analysis and designed 6 primer pairs covering HBA2 and HBA1 regions to confirm the diagnosis of alpha Hb variants in blood and DNA samples were obtained from 51 subjects including, 10 Hb Constant Spring, 3 Hb Pakse’, 1 Hb Quong Sze, 1 Hb Pak Num Po, 1 Hb Thailand, 17 Hb Q-Thailand, 1 Hb Queens, 3 Hb Hekinan, 1 Hb Siam, 1 Hb Anantharaj and 1 Hb Nakhon Ratchasima. Hb variants were collected at the Thalassemia Research unit, Naresuan University Hospital. The results of all samples were found to successful in identifying 11 types of alpha Hb variant by real-time PCR with HRM analysis and of all samples were consistent with the DNA sequencing technique. In conclusion, the diagnosis of alpha Hb variants using real-time PCR with HRM analysis has high accuracy and it is also a rapid and easy technique which can be used for the diagnosis of various Hb variants.

ฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดแอลฟาเป็นหนึ่งในความผิดปกติที่พบได้บ่อยในประเทศไทย ส่งผลให้มีการตรวจวิเคราะห์ชนิดของฮีโมโกลบินในประชากร และพบฮีโมโกลบินผิดปกติมากขึ้น ซึ่งเกือบทุกชนิดไม่สามารถให้การวินิจฉัยที่ถูกต้องได้ในงานตรวจประจำวัน ส่งผลกระทบต่อการวางแผนรักษา และการให้คำปรึกษาทางพันธุกรรมแก่ตัวผู้ป่วยและครอบครัว จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องได้รับการตรวจยืนยันในระดับดีเอ็นเอ ดังนั้นการศึกษาวิจัยนี้จึงได้พัฒนาเทคนิค Real-time PCR ร่วมกับ HRM analysis โดยได้ออกแบบไพรเมอร์ทั้งหมด 6 คู่ ครอบคลุมบริเวณยีนแอลฟาโกลบิน 2 (HBA2) และแอลฟาโกลบิน 1 (HBA1) สามารถตรวจยืนยันฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดแอลฟาจากตัวอย่างเลือด และตัวอย่างดีเอ็นเอที่ตรวจพบฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดแอลฟาจำนวน 51 ตัวอย่าง ประกอบด้วย Hb Constant Spring 21 ตัวอย่าง, Hb Pakse’ 3 ตัวอย่าง, Hb Quong Sze 1 ตัวอย่าง, Hb Pak Num Po 1 ตัวอย่าง, Hb Thailand 1 ตัวอย่าง, Hb Q-Thailand 17 ตัวอย่าง, Hb Queens 1 ตัวอย่าง, Hb Hekinan 3 ตัวอย่าง, Hb Siam 1 ตัวอย่าง, Hb Anantharaj 1 ตัวอย่าง และ Hb Nakhon Ratchasima 1 ตัวอย่าง ผลการวิเคราะห์ประสบความสำเร็จในการระบุฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดแอลฟาทั้ง 11 ชนิด ด้วยเทคนิค Real-time PCR ร่วมกับ HRM analysis และทุกตัวอย่างให้ผลสอดคล้องกับการตรวจด้วยเทคนิค DNA sequencing จึงกล่าวได้ว่า การตรวจยืนยันฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดแอลฟาด้วยเทคนิค Real-time PCR ร่วมกับ HRM analysis มีความถูกต้องแม่นยำ และมีประสิทธิภาพสูง อีกทั้งยังเป็นเทคนิคที่ง่าย สะดวก รวดเร็ว และอาจนำไปใช้ในการตรวจยืนยันฮีโมโกลบินผิดปกติชนิดอื่นๆ ได้อีกด้วย