Application of Pyrrolidinyl Peptide Nucleic Acid for Detection of Canine Blood Parasite by Hybridization Probe with Graphene Oxide

Abstract

Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME) caused by Ehrlichia spp., is a vector-borne disease with worldwide distribution. The dogs have primarily infected this bacteria through the bite of brown-dog ticks. Clinical symptoms are such as anorexia, enlarged lymph nodes, vomiting, diarrhea, leukopenia, and maybe led to death in terrible cases. A typical diagnosis for CME is a polymerase chain reaction (PCR) based on the amplification of a sequence-specific gene of interest. However, a requirement of thermocycler to control the PCR reaction-temperature becomes a majority limitation as high costs and loss of time. In recent years, an isothermal DNA amplification has been developed to reduce costs and time towards CME identification. These techniques are usually combined with a nucleic acid probe for the development of an uncomplicated and practical method as well as the enhancement of assay performance. Herein, a fluorescent-labeled conformational-constrained peptide nucleic acid (PNA) in the graphene oxide (GO) platform has been established towards E. canis’s DNA detection using the specific region of the 16S rRNA gene. This assay’s principle is based on the use of excellently targeted binding of PNA probe with DNA target, producing PNA×DNAtarget duplex which was remained or recovered fluorescence signal under GO-suspended solution. Whereas, in the case of non-targeted DNA, unbound PNA would be adsorbed on the GO surface via p-p interaction, hydrophobic driving force, and hydrogen bonding between unpaired nucleobases and functional groups of GO. Firstly, the comparison of two different types of pyrrolidinyl PNA as acpcPNA and apc/acpcPNA was examined. The apc/acpcPNA was designed to create the positive charges within the acpcPNA backbone to relieve the non-specific binding of acpcPNA by replacing the 3´APC to ACPC spacers. However, the results showed that apc/acpcPNA could not be reduced the non-specific quenching between the probe and hydrophobic surface with indicating the fluorescence signal lower than acpcPNA. In addition, the binding property with single-stranded (ss) DNA target showed that acpcPNA has a great performance to discriminate the targeted DNA from other mismatched sequences rather than apc/acpcPNA and provided the sensitivity to target with a limit of detection (LOD) in the range of 7-9 nM. Hence, an acpcPNA probe was further used in double-stranded (ds) DNA detection by developing the recombinase polymerase amplification (RPA) in combination with Deoxyribonuclease I (DNase I) enhancement and PNA/GO system (RPA-DPG assay). The results found that acpcPNA could hybridize with a sequence-specific region within targeted dsDNA at low temperature and displayed the fluorescence signal in GO-suspended solution upon digesting of non-targeted dsDNA by DNase I enzyme. The study of specific detection for targeted E. canis in comparison with pUC57-based plasmid DNAs including Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, and Hepatozoon canis, showed that the developed RPA-DPG assay has an excellent performance to distinguish the E. canis from others species and giving LOD = 2.22 fg/mL (2.47 fM). Notably, the fluorescent visualization under LED transilluminator was clearly observed with naked-eye when the concentration of the DNA template at least 10 pg/mL (11.15 pM). Based on these results, the developed RPA-DPG assay could be adopted to identify E. canis in real samples by using a general heating block with successful detection and visualization under LED transilluminator. However, the protein interference that presented in extracted DNA from the whole blood sample becomes the limitation of the RPA process (gel electrophoresis is undetectable), providing a low fluorescence signal in the detection of real clinical DNA samples.

ภาวการณ์ติดเชื้อโรคเออร์ลิชิโอสิสในสุนัข หรือ โรคพยาธิเม็ดเลือด เป็นกลุ่มของโรคที่เกิดจากแบคทีเรีย Ehrlichia spp. มีการแพร่ระบาดในหลายพื้นที่ทั่วโลก มีเห็บสุนัขสีน้ำตาลเป็นพาหะ เมื่อได้รับเชื้อมักจะมีอาการเบื่ออาหาร ต่อมน้ำเหลืองโต อาเจียน ท้องร่วง เม็ดเลือดขาวถูกทำลายจนอาจนำไปสู่การเสียชีวิตได้ การวินิจฉัยในปัจจุบันนิยมใช้การตรวจสอบดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (พีซีอาร์) ซึ่งต้องใช้เครื่องมือควบคุมอุณหภูมิที่มีราคาสูง และใช้เวลาตรวจวิเคราะห์ค่อนข้างนาน ในปัจจุบัน เทคนิคการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยอุณหภูมิระนาบเดียวถูกพัฒนาขึ้นเพื่อลดข้อจำกัดของพีซีอาร์ ลดเวลา รวมถึงค่าใช้จ่ายในการวิเคราะห์ ซึ่งมักมีการประยุกต์ใช้ร่วมกับโพรบนิวคลีอิกแอซิดเพื่อให้การตรวจสอบดีเอ็นเอสามารถทำได้ง่ายและมีประสิทธิภาพมากขึ้น ในงานวิจัยนี้ ได้ออกแบบและพัฒนาโพรบพิร์โรลิดินิลพีเอ็นเอที่ติดฉลากหมู่ให้สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ร่วมกับการใช้แกรฟีนออกไซด์ เพื่อใช้ตรวจสอบดีเอ็นเอในบริเวณที่มีความจำเพาะสูงของ 16S rRNA ของเชื้อ Ehrlichia canis ในเลือดสุนัข หลักการของเทคนิคนี้ คือใช้ความสามารถในการเข้าคู่สมอย่างจำเพาะเจาะจงของโพรบพีเอ็นเอกับดีเอ็นเอเป้าหมายเกิดเป็นเกลียวคู่ ซึ่งจะให้สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ในสารละลายของแกรฟีนออกไซด์ ในขณะที่โพรบอิสระจะถูกดูดซับบนพื้นผิวทำให้เกิดการดับแสงผ่านอันตรกิริยาแบบไพ-ไพ แรงไฮโดรโฟบิก และพันธะไฮโดรเจนของนิวคลีโอเบสกับแกรฟีนออกไซด์ ในขั้นแรกได้ศึกษาเปรียบเทียบการใช้พิร์โรลิดินิลพีเอ็นเอ 2 ชนิด ได้แก่ acpcPNA และ apc/acpcPNA โดย apc/acpcPNA ปรับปรุงโครงสร้างจาก acpcPNA โดยการแทนที่สะพานเชื่อม acpc ด้วย apc จำนวน 3 ตำแหน่ง ทำให้มีประจุบวกในโครงสร้าง เพื่อลดอันตรกิริยาแบบไม่เจาะจง อย่างไรก็ตาม การศึกษาพบว่า apc/acpcPNA ไม่สามารถลดการดับแสงแบบไม่เจาะจงได้ และให้สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่ด้อยกว่า acpcPNA และการศึกษาประสิทธิภาพในการตรวจวิเคราะห์ดีเอ็นเอสายเดี่ยว โพรบชนิด acpcPNA แสดงความจำเพาะเจาะจงต่อเป้าหมายได้ดีกว่าโพรบ apc/acpcPNA และแสดงความไวต่อเป้าหมายดีเอ็นเอ มีค่าขีดจำกัดต่ำสุดที่สามารถวิเคราะห์ได้ (LOD) อยู่ในช่วง 7-10 nM จึงเลือกใช้ acpcPNA เป็นโพรบในการตรวจสอบดีเอ็นเอเกลียวคู่ โดยได้พัฒนาวิธีตรวจสอบดีเอ็นเอที่อุณหภูมิระนาบเดียวโดยใช้ดีเอ็นเอพลาสมิดที่โคลนบน pUC57 ด้วยเทคนิคการเพิ่มปริมาณด้วยรีคอมบิเนสพอลิเมอเรส (RPA) ร่วมกับเอมไซม์ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (DNase I) และพีเอ็นเอ/แกรฟีนออกไซด์ เรียกว่า เทคนิคอาร์พีเอ-ดีพีจี (RPA-DPG: Recombinase Polymerase Amplification in combination with DNase I-enhanced PNA probe in GO platform) พบว่า โพรบพีเอ็นเอที่ออกแบบสามารถจับกับตำแหน่งเป้าหมายภายในดีเอ็นเอเกลียวคู่ที่อุณหภูมิต่ำได้ และแสดงสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ได้ชัดเจนขึ้นเมื่อย่อยดีเอ็นเอส่วนที่ไม่ถูกจับยึดด้วยเอนไซม์ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I ที่อุณหภูมิเดียวกัน นอกจากนี้ เมื่อศึกษาความจำเพาะเจาะจงต่อเชื้อ E. canis เปรียบเทียบกับพลาสมิดดีเอ็นเอที่โคลนบน pUC57 ของเชื้อปรสิตชนิด Ehrlichia canis, Anaplasma platy, Babesia canis vogeli และ Hepatozoon canis พบว่า เทคนิคนี้มีความจำเพาะเจาะจงต่อดีเอ็นเอเป้าหมายของ E. canis แสดงค่าขีดจำกัดต่ำสุดที่สามารถวิเคราะห์ได้ (LOD) เท่ากับ 2.22 fg/uL หรือ 1.5 x 103 copies/uL ขณะที่การทดสอบสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ด้วยตาเปล่าภายใต้เครื่องทรานส์อิลูมิเนเตอร์ไดโอดเปล่งแสง (LED transilluminator) เริ่มปรากฏชัดที่ความเข้มข้นของดีเอ็นเอเทมเพลตเท่ากับ 10 pg/uL จากผลการทดลอง เทคนิค RPA-DPG ที่พัฒนาขึ้น สามารถตรวจสอบเชื้อ E. canis จากดีเอ็นเอที่สกัดมาจากเลือดของสุนัขได้ ด้วยเครื่องให้ความร้อน และสามารถตรวจสอบได้ง่ายจากการเรืองแสงของสารละลายภายใต้เครื่องทรานส์อิลูมิเนเตอร์ไดโอดเปล่งแสง อย่างไรก็ตาม เทคนิคนี้ยังคงมีข้อจำกัดเรื่องโปรตีนรบกวนในสารละลายตัวอย่างต่อการเพิ่มปริมาณด้วยรีคอมบิเนสพอลิเมอเรส (ไม่สามารถวิเคราะห์ได้ด้วยเทคนิคอิเล็กโตรโฟเรซิส) ทำให้การวิเคราะห์กับตัวอย่างจริงยังแสดงสัญญาณที่ไม่ชัดมากนัก