การเพิ่มผลผลิตสารสตีลบินในการเพาะเลี้ยงรากลอยถั่วลิสงโดยการกระตุ้นด้วยไคโตซาน เมทิลจัสโมเนต และไซโคลเดกซ์ทริน

Abstract

Enhancement of stilbene compound production in peanut hairy root culture requires an elicitation process with suitable elicitor to induce a high yield of these compound production. This research focus on the study of the suitable elicitor for Kalasin 2 peanut hairy root culture. The hairy roots were treated with different elicitors as following; 1) CHT alone (CHT), 2) combination of MeJA and CD (MeJA+CD), 3) CHT followed by a combination of MeJA and CD (CHT_(MeJA+CD)), 4) combination of MeJA and CD followed by CHT ((MeJA+CD)_CHT) and 5) combination of CHT, MeJA and CD (CHT+MeJA+CD). The peanut hairy root culture medium crude extract elicited with CHT+MeJA+CD for 72h resulted in the highest amount of stilbene compound with the highest biological activity. The various oxidative stress defense mechanisms in shake flask were subsequently studied. The result showed that the culture medium crude extract elicited with CHT+MeJA+CD for 72h exhibited the highest antioxidant capacity measured by ABTS and FRAP with the value of 506.33±28.43 µmol Trolox/g dry weight and 60.38±33.48 mg ascorbic acid/g dry weight, respectively. In addition, the highest hydrogen peroxide scavenging activity with IC50 value of 76.67±2.89 ug/ml and the highest amount of total phenolic compound with 42.51±9.96 mg gallic acid/g dry weight were detected. The gene expression result using real-time PCR method demonstrated that peanut hairy root tissue elicited with CHT+MeJA+CD for 24h exhibited the highest expression level of secondary metabolite biosynthesis genes, antioxidant enzyme genes, and pathogenesis-related protein genes. All gene expression levels were decreased upon the elicitation time. The efficiency of stilbene compound production at 72h in the shake flask and bioreactor was compared and the result indicated that the amount of stilbene compounds such as trans-resveratrol, trans-arachidin-1, and trans-archidin-3 produced in the bioreactor was less than the shake flask with 0.62, 0.25 and 0.44 fold, respectively. This result can be concluded that the elicitation of peanut hairy root culture with simultaneous CHT+MeJA+CD could enhance the production of stilbene compound with high antioxidant activity and effectively induced enzymatic and non-enzymatic defense response in peanut hairy root culture. Thus, the result from this study can be applied for bioactive stilbene compound production in the agricultural industry, pharmaceutical, and medical application.

การเพิ่มผลผลิตสารกลุ่มสตีลบินในรากลอยถั่วลิสงเพาะเลี้ยงจำเป็นต้องอาศัยกระบวนการกระตุ้นด้วยตัวกระตุ้นที่เหมาะสมเพื่อเหนี่ยวนำให้มีการผลิตสารในปริมาณมาก งานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาตัวกระตุ้นที่เหมาะสมในการกระตุ้นรากลอยถั่วลิสงสายพันธุ์กาฬสินธุ์ 2 ที่แตกต่างกัน ได้แก่ 1) ไคโตซาน (CHT) 2) เมทิลจัสโมเนต (MeJA) ร่วมกับ ไซโคลเดกซ์ทริน (CD) (MeJA+CD) 3) CHT_(MeJA+CD) 4) (MeJA+CD)_CHT และ 5) CHT+MeJA+CD ผลการศึกษาพบว่า สารสกัดจากอาหารเพาะเลี้ยงรากลอยที่ได้รับการกระตุ้นด้วยตัวกระตุ้น CHT+MeJA+CD ที่ระยะเวลา 72 ชั่วโมง มีปริมาณสารกลุ่มสตีลบินที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพสูงที่สุด จากผลการศึกษาดังกล่าวได้ทำการศึกษากลไกการตอบสนองต่าง ๆ ต่อสภาวะเครียดออกซิเดชั่นในระบบขวดเขย่า พบว่าสารสกัดจากอาหารเพาะเลี้ยงรากลอยที่ได้รับการกระตุ้นที่ระยะเวลา 72 ชั่วโมง มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ตรวจสอบด้วยวิธี ABTS และ FRAP สูงที่สุด เท่ากับ 506.33±28.43 ไมโครโมล Trolox ต่อกรัมน้ำหนักแห้ง และ 60.38±33.48 มิลลิกรัม ascorbic acid ต่อกรัมน้ำหนักแห้ง ตามลำดับ นอกจากนี้ยังพบฤทธิ์กำจัดอนุมูล hydrogen peroxide สูง มีค่า IC50 เท่ากับ 76.67±2.89 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และพบปริมาณสารประกอบฟิโนลิกทั้งหมดสูงที่สุด เท่ากับ 42.51±9.96 มิลลิกรัม gallic acid ต่อกรัมน้ำหนักแห้ง เมื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีนด้วยวิธี real-time PCR พบว่าเนื้อเยื่อรากลอยที่ได้รับการกระตุ้นที่ระยะเวลา 24 ชั่วโมง มีการแสดงออกของกลุ่มยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการสังเคราะห์สารทุติยภูมิ กลุ่มยีนเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ และกลุ่มยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โปรตีนต้านทานโรคในพืชสูงที่สุด โดยการแสดงออกของยีนทุกกลุ่มจะลดลงเมื่อระยะเวลาการกระตุ้นเพิ่มมากขึ้น ผลการเปรียบเทียบประสิทธิภาพการผลิตสารกลุ่มสตีลบินที่ระยะเวลา 72 ชั่วโมง ในระบบขวดเขย่าและระบบเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ พบว่า ปริมาณสารกลุ่มสตีลบิน ได้แก่ trans-resveratrol, trans-arachidin-1 และ trans-arachidin-3 ในระบบเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ มีค่าน้อยกว่าในระบบขวดเขย่าคิดเป็น 0.62, 0.25 และ 0.44 เท่า ตามลำดับ ผลการศึกษาดังกล่าวสามารถสรุปได้ว่า การกระตุ้นรากลอยถั่วลิสงเพาะเลี้ยงด้วยตัวกระตุ้น CHT+MeJA+CD พร้อมกัน สามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการผลิตสารกลุ่มสตีลบินที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระได้ในปริมาณสูงและสามารถเหนี่ยวนำให้รากลอยถั่วลิสงเกิดการตอบสนองต่อตัวกระตุ้นที่ได้รับด้วยกลไกป้องกันตนเองทั้งในระบบเอนไซม์และไม่ใช้เอนไซม์ได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ ซึ่งสามารถนำผลการศึกษาดังกล่าวไปประยุกต์ใช้ในการผลิตสารกลุ่มสตีลบินที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญในระดับอุตสาหกรรมทางการเกษตร เภสัชกรรม และการแพทย์ต่อไป