การโคลนและการแสดงออกของยีนที่ควบคุมการสร้างวิตามินอีจากผักเสี้ยนผี

Abstract

Cleome viscosa (Cv) L. is an annual oilseed crop plant that has high vitamin E, with the most active form are represented as the tocopherols (α, β, γ and δ). These act as antioxidants in plants and are also essential components for human health. The objectives of this research were to determine the genes expression profile and partial-length cDNA encoding tocopherol cyclase (CvVTE1), homogentisic acid prenyltransferase (CvVTE2), MPBQ methyltransferase (CvVTE3), gamma-tocopherol methyltransferase (CvVTE4), hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (CvHPPD) and homogentisate solanesyltransferase (CvHST) genes, which involve the tocopherol biosynthetic enzyme. Partial cDNA sequences of six genes as 695 bp CvVTE1, 376 bp CvVTE2, 387 bp CvVTE3, 366 bp CvVTE4, 334 bp CvHPPD and 461 bp CvHST had a high degree of sequence homology with ThVTE1, ThVTE2, ThVTE3, ThVTE4, ThHPPD and ThHST from Tarenaya hassleriana. Expression levels of CvVTE1, CvVTE2, CvVTE3, CvVTE4, CvHPPD and CvHST genes were analyzed in 3 degrees of plant nodes (L1, L2 and L3) in leaves and 4 stages of seeds (1-4 weeks after fruit set (WAF)) by real-time quantitative PCR (qPCR). The high expression level of CvVTE3 and CvHPPD were found in leaves, while the seeds showed that the expression of CvVTE2 was high in both 2 and 3 WAF at 231-fold and 224-fold respectively same as CvVTE1 and CvVTE3 expression. Co-expression of CvVTE4 and CvHPPD at 4 WAF without any down-regulation supported high levels of flux toward the synthesis of tocopherols. Moreover, total phenolic content in seeds showed higher than leaves. The highest level was 2 WAF that the correlation was significant with the CvVTE2 gene expression pattern (p-value = 0.05). The results of this study indicated that CvVTE2 played a key role in tocopherol biosynthesis in the seed of C. viscosa.

ผักเสี้ยนผี (Cleome viscosa (Cv) L.) เป็นวัชพืชปีเดียวที่เมล็ดมีการสะสมน้ำมันและวิตามินอีปริมาณสูง โดยวิตามินอีที่มีประสิทธิภาพในการเกิดปฏิกิริยามากที่สุดคือ โทโคฟีรอล (α, β, γ และ δ) อนุพันธ์เหล่านี้ทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระในพืช และยังเป็นสารที่จำเป็นต่อสุขภาพของมนุษย์ วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนโทโคฟีรอลไซเคส (tocopherol cyclase (CvVTE1)) โฮโมเจนติซิคเอสิคพรีนิล ทรานสเฟอเรส (homogentisic acid prenyltransferase (CvVTE2)) เอ็มพีบีคิว เมทิลทรานสเฟอเรส (MPBQ methyl transferase (CvVTE3)) แกรมม่าโทโคฟีรอล เมทิลทรานสเฟอเรส (gamma tocopherol methyltransferase (CvVTE4)) ไฮดรอกซีฟีนิลไพรูเวตไดออกซิจีเนส (hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (CvHPPD)) และโฮโมเจนติเซต โซลานีซิลทรานสเฟอเรส (homogentisate solanesyltransferase (CvHST)) ซึ่งเกี่ยวข้องกับเอนไซม์ในวิถีการสังเคราะห์โทโคฟีรอล ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน CvVTE1 มีขนาด 695 คู่เบส CvVTE2 มีขนาด 376 คู่เบส CvVTE3 มีขนาด 387 คู่เบส CvVTE4 มีขนาด 366 คู่เบส CvHPPD มีขนาด 334 คู่เบส และ CvHST มีขนาด 461 คู่เบส ซึ่งมีความคล้ายยีน ThVTE1 ThVTE2 ThVTE3 ThVTE4 ThHPPD และ ThHST จาก Tarenaya hassleriana การวิเคราะห์ระดับแสดงออกของยีน CvVTE1 CvVTE2 CvVTE3 CvVTE4 CvHPPD และ CvHST ในใบ 3 ระยะ (L1 L2 และ L3) และเมล็ด 4 ระยะ (1-4 สัปดาห์หลังการติดผล) ด้วยเทคนิค real-time PCR พบว่าการแสดงออกของยีน CvVTE3 และ CvHPPD ในระดับที่สูงในใบ ขณะที่ในเมล็ดยีน CvVTE2 มีระดับการแสดงออกสูงช่วงระยะ 2 และ 3 สัปดาห์หลังการติดผล ที่ 231 และ 224 เท่า ตามลำดับ เช่นเดียวกันกับการแสดงออกของยีน CvVTE1 และ CvVTE3 การแสดงออกร่วมกันระหว่าง CvVTE4 และ CvHPPD ในระดับสูงที่ระยะ 4 สัปดาห์หลังการติดผล โดยไม่มีการลดระดับการแสดงออกช่วยในการสังเคราะห์โทโคฟีรอล นอกจากนี้ผลการวิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิคทั้งหมด พบว่าในเมล็ดมีปริมาณมากกว่าในใบ โดยมีปริมาณสูงที่สุดในระยะ 2 สัปดาห์หลังการติดผล ซึ่งสัมพันธ์กับรูปแบบการแสดงออกของยีน CvVTE2 อย่างมีนัยสำคัญที่ 0.05 ผลการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า CvVTE2 มีบทบาทสำคัญในการสังเคราะห์โทโคฟีรอลในเมล็ดของผักเสี้ยนผี