การศึกษาประสิทธิภาพของแอคติโนแบคทีเรียในการควบคุมโรคและการส่งเสริมการเจริญของมะนาว

Abstract

Lime is one of the most common commercial citrus. However, the common disease of this fruit was frequently caused by numerous fungi and bacteria. Typically, Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. axonopodis pv. citri) which is bacteria that is a causative agent of canker disease of many citrus varieties, i.e., kaffir lime, lime, and pomelo. The most farmers used a copper compound product to control, eliminate, and decrease the diseases leading to a problem like chemical resistance. Hence, the biological control using antagonistic microorganisms such as rhizosphere bacteria are the alternative solution. One of the most useful rhizosphere bacteria is Actinobacteria. It is a gram-positive bacterium that live in the soil rhizosphere.

A total of 22 isolates of Actinobacteria obtained from the Microbial Biotechnology Research Unit, Department of Microbiology and Parasitology, Faculty of Medical Science, Naresuan University were evaluated for their antagonistic activities against pathogenic microorganisms in the citrus.

Isolate Bar14 showed the most potent antagonistic activity against all test microorganisms (A. alternata, Aspergillus sp. and 3 isolates of X. axonopodis pv. citri.). Based on the agar well diffusion assay, the culture broth of isolate Bar14 exhibited inhibition zones 29.00±0.00, 26.67±0.58, 29.00±0.00, 26.67±0.58 and 24.33±0.58 mm. diameter against A. alternata, Aspergillus sp. and 3 isolates of X. axonopodis pv. citri. respectively.

The paper disc diffusion method used the crude extract (30 µg/disc) of isolate Bar14 gave inhibition zones 14.00±0.00, 13.00±0.00, 13.00±0.00, 15.00±0.00 and 15.00±0.00 mm. diameter against the same pathogenic isolates respectively. While copper hydroxide (a common anti-canker substance) with the same concentration does not present an inhibition zone.

The comparative results of potential inhibitory effects of crude extract against fungi by Minimum Fungicidal Concentration (MFC) assay and Percent inhibition. The highest concentration used (5 mg/ml) show that the percentage of the inhibition against A. lunata and Aspergillus sp. were 54.54% and 53.13% respectively. When we compared the inhibitory efficiency of crude extracts derived from isolate Bar 14 to copper hydroxide, the minimum bactericidal concentration (MBC) of the extracts was 5 µg/ml. In comparison, copper hydroxide could not inhibit bacterial growth even at its highest tested concentration (500 µg/ml). The strain was also assessed for the presence of plant growth promoting activity, such as auxin indole-3-acetic acid (IAA) production, siderophore production and phosphate solubilization. The production of IAA was 0.026 µg/ml when culture in ISP2 broth supplemented with 0.2% L- tryptophan. Isolate Bar14 showed a positive reaction for siderophore production with 11.67±0.58 mm-sized orange. The test for phosphate solubilization, did not produce any halo.

In vivo biocontrol efficacy of the isolate Bar 14 against X. axonopodis pv. citri in lime were tested. The results showed that after soaking lime seeds in the isolate Bar 14 culture broth or 100 µg/ml IAA solution at 4C for 24 h, the culture broth showed a greater enhancement of the lime seed germination. Lime seeds soaked in the culture broth for 24 h offered 94.44% seed germination. The effect of presoaking seeds in culture broth on seedling growth resulted in higher values of fresh weight and dry weight than IAA (0.22 and 0.14 g. respectively). The results of several stem cutting, stem cutting length, and new leaf had an average of 1.75 stem cutting, 12.50 mm. and 6 leaves. The inhibition of canker disease in lemon leaves showed a percentage of disease incidence of 0 and no disease severity. Lastly, the MTT assay of crude extract of isolate Bar14 showed that at a concentration of 50 µg/ml, 92.40% of cells survived. The results indicated that it was safe for cells. Our findings suggest that isolate Bar14 would be a promising biocontrol agent to suppress canker disease and promote the better growth in lime.

มะนาวเป็นพืชสกุลส้มที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจ โรคที่พบในมะนาวมีสาเหตุมาจากรา และแบคทีเรียโดยโรคแคงเกอร์เป็นโรคที่เป็นปัญหาสำคัญที่เกิดกับมะนาวมีสาเหตุมาจากแบคทีเรีย Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. axonopodis pv. citri) เกษตรกรส่วนใหญ่ใช้สารประกอบคอปเปอร์ในการควบคุม กำจัดและลดการเกิดโรค ทำให้เกิดการต้านทานของเชื้อต่อสารเคมีที่ใช้ การใช้วิธีการทางชีวภาพโดยการใช้จุลินทรีย์ปฏิปักษ์ โดยเฉพาะแบคทีเรียรอบรากพืชกลุ่มของแอคติโนแบคทีเรียเป็นแบคทีเรียแกรมบวกอาศัยบริเวณรอบรากพืชและในพืชเป็นอีกทางเลือกที่เป็นไปได้ในการควบคุมโรคเพื่อทดแทนการใช้สารเคมี ผลการนำเอาแอคติโนแบคทีเรียจำนวนทั้งหมด 22 ไอโซเลท จากห้องปฏิบัติการ MD330 มาทดสอบการยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ก่อโรคในพืชตระกูลส้มพบว่า ไอโซเลท Bar 14 สามารถยับยั้งได้ดีที่สุด เมื่อนำน้ำเลี้ยงมาทดสอบด้วยวิธี Agar well diffusion พบว่าสามารถยับยั้งเชื้อรา 2 สายพันธุ์ ได้แก่ A. alternata และ Aspergillus sp. และแบคทีเรีย X. axonopodis pv. citri 3 สายพันธุ์ที่เป็นสาเหตุ ของโรคแคงเกอร์ในมะกรูด มะนาวและส้มโอ มีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนใสเท่ากับ 29.00 ± 0.00, 26.67 ± 0.58, 29.00±0.00, 26.67±0.58 และ 24.33±0.58 มิลลิเมตร ตามลำดับ และเมื่อนำสารสกัดหยาบมาทดสอบด้วยวิธี Agar disc diffusion โดยใช้ปริมาณสารความเข้มข้น 30 µg/Disc พบว่าการทดสอบในเชื้อรามีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนใส 14.00±0.00 และ 13.00±0.00 มิลลิเมตร ตามลำดับ ซึ่งมีประสิทธิภาพใกล้เคียงกับ Nystatin (100 µg/disc) ซึ่งเป็นยาปฏิชีวนะที่มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อรา มีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนใส 8.00±0.00 และ 5.00±0.00 มิลลิเมตร ตามลำดับ การทดสอบในแบคทีเรียพบว่ามีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนใสเท่ากับ 13.00±0.00, 15.00±0.00 และ 15.00±0.00 มิลลิเมตร ตามลำดับ โดยมีประสิทธิภาพดีกว่าคอปเปอร์ไฮดรอกไซด์ (300 µg/disc) ซึ่งเป็นสารเคมีที่ใช้ในทางการเกษตรซึ่งผลพบว่าไม่ปรากฏโซนใส

ผลการเปรียบเทียบศักยภาพในการยับยั้งราสาเหตุโรคด้วยการเปรียบเทียบค่า MFC และเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเชื้อรา พบว่าไม่สามารถหาค่า MFC ได้เนื่องจากที่ความเข้มข้นสูงสุดที่ใช้ในการทดสอบ (5 mg/ml) มีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเชื้อรา A. lunata และ Aspergillus sp. เท่ากับ 54.54% และ 53.13% และ 62.50% ตามลำดับ

ผลการเปรียบเทียบศักยภาพในการยับยั้งแบคทีเรียสาเหตุโรคด้วยการเปรียบเทียบค่า MBC พบว่าสารสกัดหยาบของไอโซเลท Bar14 มีศักยภาพสูงกว่าคอปเปอร์ไฮดรอกไซด์ เนื่องจากไม่พบการเจริญของแบคทีเรียทดสอบที่ความเข้มข้นต่ำสุดในการทดสอบ (5 µg/ml) ในขณะที่คอปเปอร์ไฮดรอกไซด์ที่ความเข้มข้นสูงสุดในการทดสอบ (500 µg/ml) ไม่สามารถยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียทดสอบ

ผลการทดสอบความสามารถในการสร้างสารส่งเสริมการเจริญของพืชของไอโซเลท Bar14 พบว่าสามารถผลิตสาร IAA เมื่อเพาะเลี้ยงในอาหาร ISP2 broth ที่มี 0.2% L- tryptophan โดยมีปริมาณ IAA เท่ากับ 0.026 µg/ml มีความสามารถในการสร้างสารไซเดอโรฟอร์โดยให้ค่าเฉลี่ยเส้นผ่านศูนย์กลางโซนสีส้มเท่ากับ 11.67±0.58 มิลลิเมตร และไม่สามารถในการละลายสารประกอบฟอสเฟตอนินทรีย์ เมื่อนำน้ำเลี้ยงของไอโซเลท Bar14 มาทดสอบความสามารถในการยับยั้งโรคแคงเกอร์และส่งเสริมการเจริญของมะนาว พบว่าการแช่เมล็ดในน้ำเลี้ยงของไอโซเลท Bar14 บ่มที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง สามารถกระตุ้นการงอกและส่งเสริมการเจริญในระยะเพาะเมล็ดได้ดีกว่าสารละลาย IAA ความเข้มข้น 100 µg/ml โดยการแช่เมล็ดมะนาวในน้ำเลี้ยงมีเปอร์เซ็นต์การงอกเท่ากับ 94.44% และพบว่าของต้นกล้ามะนาวมีการเจริญดีกว่าการแช่ในสารละลาย IAA โดยมีค่าเฉลี่ยของน้ำหนักแห้งและน้ำหนักสดเท่ากับ 0.14 และ 0.22 กรัม ตามลำดับ ผลต่อการเจริญของมะนาวในระยะการปักชำกิ่ง พบว่า มีจำนวนกิ่ง ความยาวกิ่งและใบใหม่เพิ่มขึ้นโดยเฉลี่ยเท่ากับ 1.75 กิ่ง, 12.50 มม. และ 6 ใบ และการยับยั้งโรคแคงเกอร์ในใบมะนาวพบว่ามีเปอร์เซ็นต์การเกิดโรคเท่ากับ 0 และไม่มีความรุนแรงโรค การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ปกติ พบว่า ความเป็นพิษต่อเซลล์เม็ดเลือดขาวของสารสกัดไอโซเลท Bar14 พบว่าที่ความเข้มข้น 50 µg/ml มีเซลล์รอดชีวิต 92.40% ผลการศึกษาบ่งชี้ว่ามีความปลอดภัยต่อเซลล์ปกติต่อการนำไปใช้ผลการวิจัยสรุปได้ว่ามีความเป็นไปได้ที่จะนำไอโซเลท Bar14 ไปพัฒนาเพื่อนำไปใช้ควบคุมโรคแคงเกอร์และส่งเสริมการเจริญของมะนาว