การพัฒนาเทคนิค LAMP สำหรับระบุเพศนกปรอดหัวโขน (Pycnonotus jocosus)

Abstract

Red-whiskered bulbul (Pycnonotus jocosus) is an avian species that is a favorite in Thailand and abroad. The economic value of the Red-Whiskered bulbul is very high but the problem with breeding is that sex identification is difficult. At present, sex identification is based on the PCR technique. However, the PCR amplification and post-PCR analysis requires a laboratory with specific scientific instruments which is not convenient for field work. This study presents a method to amplify DNA samples using the LAMP technique; that is, a molecular biology technique for isothermal amplification which is highly sensitive, quick and simple for post-LAMP product visualization. Two sets of LAMP primers were designed for CHD-Z and CHD-W genes. The optimal condition for LAMP reactions and post-LAMP product visualization using the colorimetric assay were investigated. The sensitivity and specificity of LAMP reactions for sex identification were compared with conventional PCR. The result showed optimal conditions for amplification with primer sets CHD-Z and CHD-W were incubated at 63 °C for 80 minutes using 1:4 ratio of the outer primer and the inner primer. The visualization with colorimetric assay using Gel red and SYTO 9 showed 100 percent accuracy when compared with electrophoresis analysis. The sensitivity of LAMP reactions was detected at the lowest DNA at 1 nanogram which was 100-fold more sensitive than PCR technique 100. The result showed DNA could be amplified in a heat box with the efficiency equivalent to thermal cycler. In this study, a powerful method was discovered for Red‐whiskered bulbul sex identification that can be applied in field studies as it is quick and easy to perform, does not require advanced scientific equipment and decreases the cost of bird sexing.

นกปรอดหัวโขนเป็นนกที่นิยมเลี้ยงทั้งในประเทศไทยและต่างประเทศ เป็นนกที่มีมูลค่าทางเศรษฐกิจสูง แต่ปัญหาของการเพาะพันธุ์นกปรอดหัวโขน คือ การจับคู่ผสมพันธุ์ผิดของผู้เพาะเลี้ยงนก ปัจจุบันการตรวจเพศนกทั่วไปนิยมใช้เทคนิค PCR ซึ่งต้องอาศัยเครื่องมือทางวิทยาศาสตร์ขั้นสูง ไม่สะดวกในการใช้งานภาคสนาม ในการศึกษาครั้งนี้ได้ศึกษาวิธีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยเทคนิค LAMP ซึ่งเป็นเทคนิคทางชีววิทยาระดับโมเลกุล ที่ใช้อุณหภูมิเดียว มีความไวสูง รวดเร็ว รวมทั้งวิธีการตรวจสอบผลผลิตสามารถตรวจสอบได้ง่าย โดยในการศึกษาครั้งนี้ได้ออกแบบไพรเมอร์ 2 ชุด สำหรับยีน CHD-Z และ CHD-W หาสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยา LAMP และวิธีการตรวจสอบผลผลิตของปฏิกิริยาด้วยวิธี Colorimetric assay ทดสอบความไวและความจำเพาะของปฏิกิริยา LAMP เพื่อระบุเพศนกปรอดหัวโขน เปรียบเทียบกับเทคนิค PCR ผลการทดลองพบว่าสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยาสำหรับการเพิ่มปริมาณด้วยไพรเมอร์สำหรับยีน CHD-Z และ CHD-W คือ บ่มที่อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 80 นาที โดยใช้อัตราส่วนระหว่าง outer primer และ inner primer ที่ 1:4 และการตรวจสอบผลผลิตด้วยวิธี colorimetric assay ด้วยการเติม Gel red และ SYTO 9 สามารถระบุเพศนกปรอดหัวโขนได้ 100 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีอิเล็กโตรโฟรีซิส โดยปริมาณของดีเอ็นเอต่ำสุดที่สามารถเพิ่มปริมาณได้ด้วยเทคนิค LAMP อยู่ที่ 1 นาโนกรัม ซึ่งมีความไวมากกว่าเทคนิค PCR 100 เท่า โดยผลการทดลองแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วย heat box ซึ่งเทียบเท่ากับการใช้ ะhermal cycler ในการศึกษาครั้งนี้ได้ค้นพบวิธีการระบุเพศนกปรอดหัวโขนที่สามารถประยุกต์ในภาคสนามได้ สามารถทำได้ง่าย และไม่ต้องอาศัยเครื่องมือทางวิทยาศาสตร์ขั้นสูง รวดเร็ว รวมถึงลดค่าใช้จ่ายในการระบุเพศอีกด้วย