IMPROVEMENT OF STRAWBERRY FOR POTENTIAL ANTHOCYANIN PRODUCING CULTIVARS THROUGH CROSSING AND MICROPROPAGATION OF STRAWBERRY

Abstract

Strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) are one of the most economically important fruit crops in the north of Thailand. As it has a berry shape, sweetness, juicy and they are rich in natural antioxidants, which is required to meet the consumer demand. However, strawberry cultivars in Thailand generally have a low anthocyanin content, there has not been information that specifically focuses on identification, propagation, gene expression, and metabolomics. Therefore, the aim of this study was to determine the strawberry breeding programs alongside with study assesses the ability of RAPD marker, tissue culture, qRT-PCR, and metabolomics techniques such as GC-MS, LC-MS and SPME-GC-MS. RAPD markers were used to identify and assess the genetic diversity of six strawberry cultivars included Praratchatan No. 50, Praratchatan No. 70, Praratchatan No. 72, Praratchatan No. 80, No. 329, Akihime. The results revealed the total 25 primers were found 263 bands (10.52 bands to primer), of which 87.85% were polymorphic and 13.48% were monomorphic. The PCR products were between 200-5000 bp, 19 primers revealed cultivar specific PCR bands. The phylogenetic relationships of the six strawberry cultivars could be clearly distinguished three groups included No. 329, Praratchatan No. 80, Praratchatan No. 50, Praratchatan No. 70 (group I); Akihime (group II) and Praratchatan No. 72 (group III). The results showed the genetics similarity was higher between group I and II than group III. This research aimed to generate a series of strawberry hybrids population through selection of potential of anthocyanin-rich cultivars for breeding intervention. Six parental cultivars were crossed by complete diallel with a mix of the same breed and mixed breed. The results showed we selected a total number of 300 seeds for each pair for germination test. From the initial seeds, 2,540 vigorous hybrids were selected for growing on. Thirty-five plants were found to have anthocyanin concentrations higher than their parents (p < 0.05). Our results illustrated vegetative growth, reproductive growth, physico-chemical and anthocyanin content included total anthocyanin content (52.21 mg/100g FW), Cyanidin-3-glucoside (29.90 mg/kg FW) and Pelargonidin-3-glucoside (554.89 mg/kg FW) were typically significantly higher in Akihime × Praratchatan No. 80 line 66 than in other hybrid pairs (p < 0.05). The study of sterilization and effect of NAA and BA on callus, shoots and roots of the strawberry cultivar Praratchatan No.80. The results showed the sterilized explant by Clorox® (NaOCl) level 3% for 20 min had the highest survival rate (80%). The most of survival rates of explant on callus induction were grown on medium supplemented with different concentration of NAA and BA. The results showed MS medium supplemented with 1.0 mg/L NAA + 1.5 mg/L BA was the best medium to induce callus tissue with a maximum width and length of 2.10 cm and 2.74 cm, respectively. The callus grown on MS medium supplemented with 2.0 mg/L BA generated explants with the highest number of shoots (38.9 shoots/explant) and length of shoot (7.24 cm). The explants from MS supplemented with 2.0 mg/L BA grown on MS without NAA generated the highest numbers of roots (16.9 roots/shoot) and root length (4.31 cm). In vitro young plantlets were transplanted and grown on different planting materials for 3 months. The results showed soil : sand (1:1 v/v) had the highest of percentage survival (91%), canopy height (15.77 cm), canopy width (20.65 cm), no. of leaves (13.79 leaves/plant), no. of runners (5.36 runner/plant) and no. of clusters (7.35 cluster/plant). The objectives of this research were to study the correlation between type and amounts of anthocyanins and expression levels of the F3’H gene at four fruit developmental stages in two strawberry cultivars; Praratchatan No. 70 and Praratchatan No. 80. The results showed both Cyanidin-3-glucoside (16.78 mg/kg FW) and gene expression of F3’H (10.26 fold) in Praratchatan No. 70 were typically higher than that Praratchatan No. 80 (p < 0.05). This difference gradually increased to the stage when the maximum concentration occurred (T, 25 day after anthesis; DAA), and then decreased slightly at the ripe red stage (R; 30 DAA). The results indicated F3’H gene will control the quantity of Cyanidin-3-glucoside in pathway of anthocyanin of strawberry fruits. The bright red stage of fruit development, 25 DAA, was found to be the optimal time to harvest the fruit for healthy consumption. The aim of this study was to measure metabolite composition of six strawberry cultivars. The results showed metabolite diversity of strawberry leaf could be clearly distinguished into three groups included No. 329, Praratchatan No. 50, Praratchatan No. 70 (group I); Praratchatan No. 80 (group II) and Praratchatan No. 72, Akihime (group III). Both genetics and metabolite compounds were higher in Praratchatan No. 70 and Praratchatan No. 50 than Praratchatan No. 70 and Praratchatan No. 72. Metabolite changes of strawberry fruit development was found myo-inositol, TCA cycle, sucrose, Vitamin C and phenolic compounds in Praratchatan No. 80 were typically higher than Akihime. This suggests that the resistant Praratchatan No.80 also has a higher nutritional quality. Contrary to this, Akihime showed a steady accumulation of amino acids and fatty acids levels. The products of this reaction can be used as precursors for biosynthesis of volatile esters, which were higher in Akihime than Praratchatan No. 80.

สตรอว์เบอร์รี (Fragaria × ananassa Duch.) เป็นไม้ผลเศรษฐกิจชนิดหนึ่งที่นิยมปลูกกันมากโดยเฉพาะในเขตพื้นที่ภาคเหนือ เนื่องจากสตรอว์เบอร์รีเป็นผลไม้ที่มีรูปทรงสวยงาม มีรสชาติหวานฉ่ำ และอุดมไปด้วยคุณค่าทางสารอาหารซึ่งทำให้เป็นที่ต้องการของผู้บริโภค แต่ปัญหาหนึ่งพบว่า สตรอว์เบอร์รีที่ปลูกเป็นสายพันธุ์ทางการค้าในประเทศไทยยังคงมีข้อจำกัดบางประการ เช่น มีปริมาณสารแอนโทไซยานินที่ต่ำ รวมทั้งยังมีข้อบกพร่องในด้านลักษณะประจำพันธุ์ วิธีการขยายพันธุ์ การแสดงออกของยีน และการเปลี่ยนแปลงของสารเมตาโบไลท์ภายในเซลล์ ดังนั้นแนวทางหนึ่งที่จะประสบความสำเร็จ คือ ทำการปรับปรุงพันธุ์ ร่วมกับการตรวจสอบลักษณะประจำพันธุ์ด้วยเทคนิค RAPD ศึกษาการขยายพันธุ์ด้วยเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ศึกษาการแสดงออกของยีนด้วยเทคนิค qRT-PCR และศึกษาชนิดสารเมตาโบไลท์ด้วยเทคนิค GC-MS, LC-MS และ SPME-GC-MS เป็นต้น จากการศึกษาการจำแนกลักษณะประจำพันธุ์สตรอว์เบอร์รี จำนวน 6 สายพันธุ์ ได้แก่ สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 50 พันธุ์พระราชทาน 70 พันธุ์พระราชทาน 72 พันธุ์พระราชทาน 80 พันธุ์ 329 และพันธุ์ Akihime ด้วยเทคนิค RAPD ผลการทดลองพบว่า จากการทดสอบทั้งหมด 25 ไพรเมอร์ ซึ่งทุกไพรเมอร์ให้จำนวนแถบผลผลิตพีซีอาร์ทั้งหมด 263 แถบ หรือเฉลี่ยเท่ากับ 10.52 แถบต่อไพรเมอร์ เปอร์เซ็นต์ polymorphic มีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 87.85% เปอร์เซ็นต์ monomorphic มีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 13.48% และขนาดผลผลิตพีซีอาร์มีค่าเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 200-5000 bp นอกจากนี้ยังพบว่า มีเพียง 19 ไพรเมอร์ ที่ให้ขนาดผลผลิตพีซีอาร์ที่จำเพาะ (specific bands) จากการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของสตรอว์เบอร์รีจำนวน 6 สายพันธุ์ พบว่าสามารถจำแนกสตรอว์เบอร์รีได้ทั้งหมด 3 กลุ่มโดยกลุ่มที่ 1 ได้แก่ สตรอว์เบอร์รีพันธุ์ 329 พันธุ์พระราชทาน 80 พันธุ์พระราชทาน 50 และพันธุ์พระราชทาน 70 กลุ่มที่ 2 ได้แก่ พันธุ์ Akihime และกลุ่มที่ 3 ได้แก่ พันธุ์พระราชทาน 72 ซึ่งแสดงให้เห็นว่า สตรอว์เบอร์รีกลุ่มที่ 1 และ 2 มีความใกล้ชิดทางพันธุกรรมมากกว่าสตรอว์เบอร์รีกลุ่มที่ 3 จากนั้นจึงนำสตรอว์เบอร์รีสายพันธุ์พ่อแม่ จำนวน 6 สายพันธุ์ มาทำการปรับปรุงพันธุ์เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์ที่มีศักยภาพในการผลิตสารแอนโทไซยานิน ผลการทดลองพบว่า จากการปลูกทดสอบสตรอว์เบอร์รีเมล็ดลูกผสม F1 คู่ผสมละ 300 เมล็ดพบว่า ทุกคู่ผสมมีการรอดชีวิตทั้งสิ้น 2,540 ต้น จากนั้นจึงทำการคัดเลือก ผลการทดลองพบว่าสามารถคัดเลือกต้นสตรอว์เบอร์รีสายพันธุ์ลูกผสม F1 ที่มีศักยภาพในการผลิตสารแอนโทไซยานินได้ปริมาณสูงกว่าสายพันธุ์พ่อแม่จำนวนทั้งหมด 35 ต้น โดยพบว่าสตรอว์เบอร์รีคู่ผสมระหว่างพันธุ์ Akihime×พันธุ์พระราชทาน 80 ต้นที่ 66 มีแนวโน้มการเจริญเติบโตทางด้านลำต้น การเจริญเติบโตทางด้านการสืบพันธุ์ คุณสมบัติทางเคมีกายภาพและปริมาณแอนโทไซยานิน เช่น ปริมาณแอนโทไซยานินทั้งหมดเฉลี่ยเท่ากับ 52.21 mg/100g FW, Cyanidin-3-glucoside มีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 29.90 mg/kg FW และ Pelargonidin-3-glucoside มีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 554.89 mg/kg FW ซึ่งมากกว่าสตรอว์เบอร์รีสายพันธุ์ลูกผสม F1 อื่นๆ ซึ่งแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95% จากการศึกษาการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 80 ในสภาพปลอดเชื้อ ผลการทดลองพบว่า การฟอกฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อเจริญปลายยอด (apical meristem) ด้วยสารละลายคลอรอกซ์ (NaOCl) ที่ระดับความเข้มข้น 3% เป็นระยะเวลา 20 นาที มีความเหมาะสมมากที่สุด โดยมีเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตมากถึง 80% จากนั้นนำชิ้นส่วนที่มีเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตมากที่สุดมาชักนำให้เกิดแคลลัส ผลการทดลองพบว่า อาหารสูตรสังเคราะห์ MS ที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต NAA 1.0 mg/L + BA 1.5 mg/L สามารถชักนำให้เกิดแคลลัสได้มากที่สุด โดยพบว่า แคลลัสมีขนาดความกว้างเฉลี่ยเท่ากับ 2.10 เซนติเมตร และความยาวเฉลี่ยเท่ากับ 2.74 เซนติเมตร หลังจากนั้นจึงนำแคลลัสจากสูตรอาหารที่มีการเจริญเติบโตดีที่สุดมาชักนำให้เกิดยอด ผลการทดลองพบว่า อาหารสูตรสังเคราะห์ MS ที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ที่ระดับความเข้มข้น 2.0 mg/L สามารถชักนำให้แคลลัสพัฒนาเป็นยอดได้ดีที่สุด โดยพบว่า มีจำนวนยอดเฉลี่ยเท่ากับ 38.95 ยอดต่อชิ้นส่วน และความสูงยอดเฉลี่ยเท่ากับ 7.24 เซนติเมตร จากนั้นจึงนำยอดจากสูตรอาหารที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต BA ที่ระดับความเข้มข้น 2.0 mg/L มาชักนำให้เกิดราก พบว่า อาหารสูตรสังเคราะห์ MS ที่ไม่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต NAA (ชุดควบคุม) มีประสิทธิภาพในการชักนำให้ยอดพัฒนาเป็นรากได้ดีที่สุด โดยมีจำนวนรากเฉลี่ยเท่ากับ 16.93 รากต่อยอด และความยาวรากเฉลี่ยเท่ากับ 4.31 เซนติเมตร หลังจากนั้นจึงทำการคัดเลือกต้นสตรอว์เบอร์รีที่มีสภาพต้นสมบูรณ์ออกปลูก ผลการทดลองพบว่า วัสดุปลูก ได้แก่ ดินลำดวน : ทราย อัตราส่วน 1:1 (v/v) มีเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตและการเจริญเติบโตทางด้านลำต้นดีที่สุดในทุกๆ ด้าน โดยพบว่าที่ระยะเวลา 3 เดือน มีเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตมากถึง 91% ความสูงทรงพุ่มเฉลี่ยเท่ากับ 15.77 เซนติเมตร ความกว้างทรงพุ่มเฉลี่ยเท่ากับ 20.65 เซนติเมตร จำนวนใบเฉลี่ยเท่ากับ 13.79 ใบต่อต้น จำนวนไหลเฉลี่ยเท่ากับ 5.36 ไหลต่อต้น และจำนวนกอเฉลี่ยเท่ากับ 7.35 กอต่อต้น จากการศึกษาการแสดงออกของยีน F3’H ในวิถีการสังเคราะห์แอนโทไซยานิน ด้วยเทคนิค qRT-PCR ของสตรอว์เบอร์รีทั้งสองสายพันธุ์ ได้แก่ พันธุ์พระราชทาน 70 และพันธุ์พระราชทาน 80 โดยศึกษาทั้งหมด 4 ระยะ ได้แก่ ระยะผลสีเขียว (G; 15 วันหลังดอกบาน) ระยะผลสีขาว (W; 20 วันหลังดอกบาน) ระยะผลสีชมพู (T; 25 วันหลังดอกบาน) และระยะผลสีแดง (R; 30 วันหลังดอกบาน) ผลการทดลองพบว่า ปริมาณ Cyanidin-3-glucoside ในสตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 70 มีค่ามากที่สุดเฉลี่ยเท่ากับ 16.78 mg/kg FW นอกจากนี้เมื่อพิจารณาการแสดงออกของยีน F3’H ผลการทดลองพบว่า สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 70 ยังคงมีปริมาณการแสดงออกของยีน F3’H มากที่สุดเฉลี่ยเท่ากับ 10.26 เท่า โดยพบมากที่สุดในระยะผลสีชมพู และจะลดลงในระยะผลสุก จากผลการทดลองสามารถบ่งชี้ได้ว่า ยีน F3’H จะทำหน้าที่ควบคุมการแสดงออกของสาร Cyanidin-3-glucoside และยังพบว่าระยะที่เหมาะสมสำหรับการบริโภคผลสตรอว์เบอร์รีควรเป็นระยะผลสีชมพู (25 วันหลังดอกบาน) เนื่องจากให้ปริมาณสารแอนโทไซยานินสูงที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับระยะผลอื่น ๆ ซึ่งแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95% จากการศึกษาสารเมตาโบไลท์ในใบสตรอว์เบอร์รี จำนวน 6 สายพันธุ์ พบว่า สามารถจำแนกสตรอว์เบอร์รีได้ทั้งหมด 3 กลุ่ม โดยกลุ่มที่ 1 ได้แก่ สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 70 พันธุ์พระราชทาน 50 และพันธุ์ 329 กลุ่มที่ 2 ได้แก่ สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 80 และกลุ่มที่ 3 ได้แก่ สตรอว์เบอร์รีพันธุ์ Akihime และพันธุ์พระราชทาน 72 เมื่อเปรียบเทียบข้อมูลทางด้านพันธุกรรม และสารเมตาโบไลท์ในใบสตรอว์เบอร์รี พบว่า มีความคล้ายคลึงกัน โดยสตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 50 และพันธุ์พระราชทาน 70 มีความเหมือนกันมากที่สุด ในขณะที่สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 70 และพันธุ์พระราชทาน 72 มีความเหมือนกันน้อยที่สุด เมื่อพิจารณาชนิดของสารเมตาโบไลท์ในผลพบว่า สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 80 มีสารเมตาโบไลท์ที่สำคัญ ได้แก่ myo-inositol, TCA cycle, sucrose, Vitamin C และ phenolic compounds ซึ่งสามารถบ่งชี้ได้ว่า สตรอว์เบอร์รีพันธุ์พระราชทาน 80 มีค่าความหวานและสามารถต้านทานต่อโรคและแมลงได้ดีกว่าสตรอว์เบอร์รีสายพันธุ์ Akihime ในขณะที่สตรอว์เบอร์รีพันธุ์ Akihime มีสารเมตาโบไลท์ที่สำคัญ ได้แก่ fatty acid และ amino acids ในปริมาณมาก ซึ่งสามารถบ่งชี้ได้ว่า สตรอว์เบอร์รีพันธุ์นี้มีกลิ่นที่หอมกว่าสตรอว์เบอร์รีสายพันธุ์พระราชทาน 80