การคัดกรองแอคติโนแบคทีเรียที่ผลิตรงควัตถุและฤทธิ์ต้านแบคทีเรียสำหรับการย้อมสีไหม

Abstract

This study aimed to isolate antibacterial pigment-producing actinobacteria from plant root-associated soils. A total of 194 actinobacteria isolates were isolated, and 44 isolates were found capable of pigment production on broken-rice as a solid substrate. Ethyl acetate crude extracts were tested against some bacteria: Escherichia coli TISTR 527, Pseudomonas aeruginosa DMST 15501, Staphylococcus aureus DMST 4745, and Staphylococcus epidermidis TISTR 518 by using the paper disc diffusion method. The bioassay results showed that eight extracts from actinobacteria isolates inhibited the growth of only gram-positive bacteria. The ethyl acetate crude extract from TN183 at concentration 100 µg/disc had a strongest inhibitory against S. epidermidis TISTR 518 and S. aureus DMST 4745 by showing the diameter zone at 17.63±1.48 and 11.50±0.87 mm, respectively. These eight isolates of actinobacteria were analyzed for the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene by EzBioCloud database. The result revealed that they were grouped in the genus Streptomyces, namely Streptomyces sp. (TN012, TN052 and TN195), Streptomyces shenzhenensis (TN015), Streptomyces adustus (TN105), Streptomyces gramineus (TN166 and TN183), and Streptomyces aquilus (TN215). In this study, chemical constituents in TN183 ethyl acetate crude extract were separated using column chromatography along with bioautography. The fractions obtained were then analyzed using LC-QTOF-MS/MS. All 37 groups of compounds were isolated from the TN183 crude extract using column chromatography (column 2). Sub-fractions 22-31 inhibited the growth of S. epidermidis TISTR 518 in the bioautographic assay. Sub-fractions 26-28 (5 µg/disc) inhibited the growth of S. epidermidis when tested using the paper disc diffusion method. The inhibitory zone on the sub-fraction 28 was the largest, measuring 20.03±0.60 mm, followed by the sub-fraction 26 and sub-fraction 27, measuring 18.33±0.22 and 18.90±0.50 mm, respectively. In LC-QTOF-MS/MS analysis, the fraction 26 contained actinomycin D and actinomycin X2, while the fraction 27-28 contained actinomycin D, actinomycin X2, and actinomycin X0β. The dyeing performance of eight actinobacteria crude extracts on silk fibers are found in different three colors; pink, orose, and yellow. The AATCC 100-2019 method for the antibacterial test of crude extract TN183 after dying on silk revealed that 99.99% of S. aureus grew, while the AATCC 147-2011 qualitative test on silk revealed an inhibitory area of 7.4 mm. Moreover, crude extract TN183 showed non cytotoxicity effects against cell line L929 with IC50 value of 0.029 µg/ml. The findings of this study will be used to investigate the dyeing potential of TN183 as a bio-dye for silk in the future in order to develop a bioactive silk dye technique.

การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อแยกแอคติโนแบคทีเรียที่ผลิตรงควัตถุต้านแบคทีเรียจากดินบริเวณรอบรากพืช โดยมีแอคติโนแบคทีเรียที่แยกได้ทั้งหมด 194 ไอโซเลต และพบว่ามีแอคติโนแบคทีเรียจำนวน 44 ไอโซเลตที่สามารถผลิตรงควัตถุบนปลายข้าวซึ่งใช้เป็นสับสเตรตได้ จากนั้น นำสารสกัดหยาบเอทิลอะซิเตตมาทดสอบกับแบคทีเรียบางชนิด ได้แก่ Escherichia coli TISTR 527, Pseudomonas aeruginosa DMST 15501, Staphylococcus aureus DMST 4745 และ Staphylococcus epidermidis TISTR 518 โดยวิธี paper disc diffusion ผลการทดสอบพบว่า สารสกัดจากแอคติโนแบคทีเรียที่แยกได้ 8 ชนิด สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียเพียงกลุ่มแกรมบวกเท่านั้น ทั้งนี้พบว่า สารสกัดหยาบเอทิลอะซิเตตจาก TN183 ที่ความเข้มข้นเท่ากับ 100 ไมโครกรัมต่อดิสก์ มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ S. epidermidis TISTR 518 และ S. aureus DMST 4745 ได้ดีที่สุด โดยมีเส้นผ่านศูนย์กลางบริเวณยับยั้งเท่ากับ 17.63±1.48 และ 11.50±0.87 มิลลิเมตร ตามลำดับ เมื่อทำการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rRNA ของแอคติโนแบคทีเรียจำนวน 8 ชนิด โดยเปรียบเทียบฐานข้อมูล EzBioCloud ปรากฏว่าแอคติโนแบคทีเรียทั้งหมดจัดอยู่ในสกุล Streptomyces ซึ่งได้แก่ Streptomyces sp. (TN012, TN052 และ TN195), Streptomyces shenzhenensis (TN015), Streptomyces adustus (TN105), Streptomyces gramineus (TN166 และ TN183) และ Streptomyces aquilus (TN215) ในการศึกษานี้ ทำการแยกองค์ประกอบทางเคมีในสารสกัดหยาบเอทิลอะซิเตต TN183 ด้วยคอลัมน์โครมาโตกราฟีร่วมกับเทคนิคไบโอออโตกราฟฟี จากนั้นนำส่วนแยกย่อยที่ได้ไปวิเคราะห์โดยใช้ LC-QTOF-MS/MS เมื่อนำสารสกัดหยาบไอโซเลต TN183 มาแยกสารที่มีฤทธิ์ต้านแบคทีเรียด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟี (คอลัมน์ที่ 2) สามารถแยกสารได้ทั้งหมด 37 กลุ่ม จากนั้นนำกลุ่มสารที่แยกได้มาศึกษาด้วยเทคนิค bioautography พบว่า sub-fraction กลุ่มที่ 22-31 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของ S. epidermidis TISTR 518 ได้ เมื่อทำการทดสอบด้วยวิธี paper disc diffusion method พบว่า sub-fraction กลุ่มที่ 26-28 (ความเข้มข้นเท่ากับ 5 ไมโครกรัมต่อดิสก์) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของ S. epidermidis TISTR 518 ได้ โดย sub-fraction กลุ่มที่ 28 มีเส้นผ่านศูนย์กลางบริเวณยับยั้งมากที่สุดเท่ากับ 20.03±0.60 มิลลิเมตร รองลงมาคือ sub-fraction กลุ่มที่ 26 และ 27 เท่ากับ 18.33±0.22 และ 18.90±0.50 มิลลิเมตร ตามลำดับ เมื่อทำการวิเคราะห์ส่วนแยกย่อยด้วย LC-QTOF-MS/MS พบว่า sub-fraction กลุ่มที่ 26 ตรวจพบสาร actinomycin D และสาร actinomycin X2 ในขณะที่sub-fraction กลุ่มที่ 27-28 พบสาร actinomycin D, actinomycin X2 และ actinomycin X0β จากการศึกษาประสิทธิภาพการย้อมสีของสารสกัดหยาบของแอคติโนแบคทีเรีย 8 ชนิดบนเส้นใยไหม พบการติดสี 3 สีที่แตกต่างกัน ได้แก่ สีชมพู สีโอโรส และสีเหลือง และเมื่อทดสอบศักยภาพในการต้านแบคทีเรีย S. aureus ของสารสกัดหยาบ TN183 บนผ้าไหมด้วยการทดสอบเชิงปริมาณด้วยวิธี AATCC 100-2019 แสดงการยับยั้งการเจริญเติบโตของ S. aureus ได้เท่ากับ 99.99 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่ผลทดสอบเชิงคุณภาพด้วยวิธี AATCC 147-2011 พบว่า มีบริเวณใสยับยั้งเท่ากับ 7.4 มิลลิเมตร นอกจากนี้ สารสกัดหยาบเอทิลอะซิเตตจาก TN183 ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์เนื้อเยื่อใต้ผิวหนังของหนูชนิด L929 โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 0.029 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ทั้งนี้ ผลจากการศึกษานี้จะนำไปใช้ในการศึกษาศักยภาพในการย้อมสีของ TN183 ในฐานะสารสีชีวภาพสำหรับผ้าไหมเพื่อพัฒนาเป็นต้นแบบสีย้อมไหมที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพต่อไปในอนาคต