An in vivo effect of recombinant human secretory leukocyte protease inhibitor in myocardial ischaemia/reperfusion injury

Abstract

Proteolysis by the protease enzyme aggravates myocardial ischaemia/reperfusion (I/R) injury by expanding the injured area and inducing inflammation. These lead to impaired cardiac function and cardiac structure, which contribute to cardiac remodelling and heart failure. Inhibition of proteases seems to provide therapeutic benefit. Our previous study demonstrated that giving recombinant human secretory leukocyte protease inhibitor (rhSLPI) by means of overexpression of the rhSLPI gene or treatment with recombinant protein of human SLPI provided a cytoprotective effect against I/R injury. Unfortunately, the information mostly came from an in vitro and an ex vivo experiment with pre-ischaemic treatment. Nevertheless, the roles and consequences of rhSLPI in the post-ischemic period, especially in an in vivo model, as well as post-ischaemic cardiac remodelling and hypertrophy have not been intensively investigated. In this study, recombinant human (rh)SLPI was administered intravenously during left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and the onset of reperfusion. The results showed that post-ischaemic treatment with rhSLPI could significantly reduce infarct size, lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase-MB (CK-MB) activity, inflammatory cytokines, and protein carbonyl levels, as well as improve cardiac functions. The intracellular mechanistic explanation for the cardioprotection is due to inhibition of p38 MAPK phosphorylation, downregulation of Bax, caspase-3 and 8 protein levels, and activation of Akt and ERK1/2 phosphorylation. In summary, this is the first report showing the cardioprotective effects against myocardial I/R injury of post-ischaemic treatments with rhSLPI in vivo.

Although the cardioprotective effect of SLPI is proven, it remains unclear whether the cardioprotective effect of SLPI seen in our previous work is due to inhibition of protease enzymes. Therefore, an anti-protease deficient mutant SLPI has been developed to investigate if the cardioprotective effect is dependent upon its anti-protease activity. In this part, recombinant protein of anti-protease deficient mutant SLPI (L72K, M73G, L74G), or mt-SLPI, was intravenously administered to rats after they were subjected to LAD ligation. The results showed that mt-SLPI could significantly reduce cardiac cell death, and intracellular reactive oxygen species (ROS) production against an in vitro simulated I/R injury. Furthermore, post-ischaemic treatment of mt-SLPI could significantly reduce infarct size and cardiac biomarkers such as lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase-MB (CK-MB) activity, improve cardiac functions, attenuate I/R induced-p38 MAPK phosphorylation, and reduce apoptotic regulatory protein levels, including Bax, cleaved-Caspase-3 and total Capase-8, in rats subjected to an in vivo I/R injury. Additionally, the beneficial effect of mt-SLPI was not significantly different from wild-type (wt-SLPI). Thus, anti-protease deficient mutant SLPI could also provide a cardioprotective effect, which could be more clinically beneficial in terms of providing cardioprotection without interfering with basal serine protease activity.

In summary, post-ischemic treatment of recombinant human SLPI could be used as a future novel therapeutic alternative for myocardial I/R injury.

ภาวะบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจที่เกิดจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือดเป็นผลมากจากการย่อยสลายของโปรตีนของเอนไซม์โปรตีเอสซึ่งส่งผลทำให้บริเวณการบาดเจ็บและเกิดการอักเสบเพิ่มมากขึ้น การบาดเจ็บและการอักเสบที่เกิดขึ้นยังส่งผลทำให้การความผิดปกติของการทำงานและโครงสร้างของหัวใจซึ่งส่งผลทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของกล้ามเนื้อหัวใจและภาวะหัวใจล้มเหลวในที่สุด การยับยั้งการย่อยสลายของโปรตีนที่เกิดจากเอนไซม์โปรตีเอสจึงเป็นเป้าหมายในการรักษาที่เหมาะสม ในการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าผลของตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ทั้งการเพิ่มการแสดงออกของยีนและการให้ตัวยับยั้งในภาวะการบาดเจ็บจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือด แสดงให้เห็นว่าตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์มีความสามารถในการป้องกันการบาดเจ็บที่เกิดขึ้นได้ อย่างไรก็ตามผลศึกษาที่เกิดขึ้นยังคงเป็นผลศึกษาจากการให้ตัวยับยั้งดังกล่าวก่อนเกิดภาวะการขาดเลือดในระดับ in vitro และ ex vivo เท่านั้นนอกจากนี้บทบาทและผลของการให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์หลังจากเกิดภาวะการขาดเลือดในสัตว์ทดลองและภาวะกล้ามเนื้อหัวใจเปลี่ยนรูปร่างและหัวใจล้มเหลวยังคงไม่ได้รับการศึกษา ดังนั้นในการศึกษานี้จึงมีการให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ผ่านทางหลอดเลือดดำของสัตว์ทดลองระหว่างที่ทำการผ่าตัดจำลองภาวะบาดเจ็บจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือดและหลังจากเริ่มการไหลกลับของเลือดที่กล้ามเนื้อหัวใจ โดยมีการผ่าตัดจำลองภาวะกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือดโดยการผูกมัดหลอดเลือดเลี้ยงกล้ามหัวใจด้านซ้าย left anterior descending coronary artery (LAD) ผลศึกษาพบว่าการให้ตัวยับยั้งภายหลังจากภาวะการขาดเลือดส่งผลให้ลดขนาดการตายของกล้ามเนื้อหัวใจ, ลดระดับของ lactate dehydrogenase (LDH) และ creatine kinase-MB (CK-MB), การอักเสบ, protein carbonyl และช่วยในเรื่องการทำงานของหัวใจอีกด้วย ผลการศึกษาดังกล่าวสอดคล้องกับการลดการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ภายในเซลล์ที่ประกอบไปด้วย p38 MAPK, Bax, caspase-3และ caspase-8 นอกจากนี้การให้ตัวยับยั้งยังเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนที่ช่วยในการรอดชีวิตของเซลล์ได้แก่ Akt และ ERK1/2 โดยสรุปแล้วการศึกษานี้เป็นการศึกษาแรกที่มีการรายงานความสามารถในการป้องกันหัวใจผลของการให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ภายหลังการเกิดขึ้นภาวะบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจที่เกิดจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือดในสัตว์ทดลอง

แม้ว่าการให้ตัวยับยั้งจะแสดงให้เห็นผลของความสามารถในการป้องกันหัวใจในภาวะบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจที่เกิดจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือด แต่อย่างไรก็ตามความสามารของยับยั้งยังคงไม่ชัดเจนซึ่งจากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าผลของตัวยั้งน่าจะเกิดจากการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์โปรตีเอส ดังนั้นการศึกษาผลของการให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ที่บกพร่องในการยับยั้งโปรตีเอสเอนไซม์จึงได้รับการศึกษาในการทดลองถัดไป ในส่วนนี้การให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ที่บกพร่องในการยับยั้งโปรตีเอสเอนไซม์(L72K, M73G, L74G), mt-SLPI ในระดับเซลล์และสัตว์ทดลองที่มีการจำลองภาวะผ่าตัดจำลองภาวะบาดเจ็บจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือดและหลังจากเริ่มการไหลกลับของเลือด โดยทำการผูกมัดหลอดเลือด LAD และจำลองภาวการณ์บาดเจ็บในระดับเซลล์ ผลการศึกษาผลพบว่าในระดับเซลล์ การให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ที่บกพร่องในการยับยั้งโปรตีเอส ตัวยับยั้งดังกล่าวสามารถลดการตายของเซลล์ระดับของ reactive oxygen species (ROS)ได้อย่างมีนัยสำคัญในภาวะจำลองการบาดเจ็บ นอกจากนี้จากให้ตัวยับยั้งดังกล่าวในสัตว์ทดลองพบว่า สามารถลดขนาดของที่มีการตายของกล้ามเนื้อหัวใจและระดับของ LDH และ CK-MB และยังช่วยการทำงานของหัวใจซึ่งลอดคล้องกับการลดลงของการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องการตายภายในเซลล์ซึ่งประกอบไปด้วย p38 MAPK, Bax, caspase-3และ caspase-8 จะเห็นได้ว่าผลการป้องกันของตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ที่บกพร่องในการยับยั้งโปรตีเอสเอนไซม์ ไม่แตกต่างจากตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ ดังนั้นการให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์ที่บกพร่องในการยับยั้งโปรตีเอสเอนไซม์จึงอาจเป็นแนวทางใหม่ในการป้องกันการบาดเจ็บของหัวใจโดยไม่มีการรบกวนการทำงานของเอนไซม์ชนิดเซอรีนโปรตีเอสอื่นๆภายในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ

ดังนั้นการให้ตัวยับยั้งชนิดซีครีโทรีลิวโคไซด์โปรตีเอสมนุษย์อาจเป็นแนวทางใหม่ในการรักษาภาวะบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจที่เกิดจากการขาดเลือดและการไหลกลับของเลือด