การศึกษาสภาวะการเลี้ยงต่อการผลิตเบต้าแคโรทีนและสัดส่วนไอโซเมอร์ของสาหร่าย Dunaliella salina NUAC09 สายพันธุ์ไทย

Abstract

Dunaliella is an important green microalga for the production of ß-carotene pigment, which is the economically important substance and high effective radical scavenging capacity. Hence, there are several applications of this pigment in various industries such as nutritional supplements, pharmaceutics, cosmetics and aquaculture. This study was focused on the identification of Thai Dunaliella salina NUAC09 based on morphological and molecular (18S rDNA and ITS region) analyses. Subsequently, nutrient factors affecting to growth performance, pigments content and ß-carotene isomers and inhibition of scavenging activity of Thai D. salina NUAC09 have also been determined. The results showed that the morphological features of NUAC09 including cell dimension, cell structure, organelles, shape, and life cycle were closely related to the description of the genus Dunaliella. When compared sequence by BLAST analyses, D. salina NUAC09 shared more than 99% similarity of 18S rDNA and 95% similarity of ITS sequences with the strains identified as D. salina. Correspondingly, the ITS phylogenetic trees showed that a strain NUAC09 was grouped in to the D. salina clade (ML = 93% and NJ = 85%). Hence, all morphological and molecular results indicated that our strain NUAC09 could be classified as D. salina. In this study, nutrient factors within the modified Johnson’s medium such as nitrogen (0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00 g KNO3/L), phosphorus (0.000, 0.043, 0.053, 0.070 g KH2PO4/L), salinity (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 M NaCl), and bicarbonate (0.00, 0.022, 0.043, 0.065, 0.086 g NaHCO3/L) were optimized. Each experiment has been separately performed with a completely randomized experimental design (CRD). The cell in each experiment was cultured in photobioreactor system for 14 days and growth performance, biomass and pigment content were determined an interval of 2 days. Furthermore, ß-carotene isomers composition analysis has been determined by HPLC analysis. The results revealed that increasing concentrations of each nutrient factors studied (nitrogen, phosphorus, salinity and bicarbonate) promoted the cell density, chlorophyll a content and biomass productivity of D. salina NUAC09. In contrast, the total carotenoid content was decreased (p≤0.05) in all experiments with the low concentration of each factor. Moreover, the results showed that the maximum cell growth (3.49 - 6.09 cell/mL), specific growth rate (0.57 - 0.82 µ/day) and chlorophyll a content (6.46 - 18.43 µg/mL) occurred in the tested strain relating with the nitrogen 2.00 g KNO3/L, phosphorus 0.070 g KH2PO4/L, salinity 2.5 M NaCl and bicarbonate 0.043 g NaHCO3/L. Interestingly, our results showed that the most obvious ß–carotene isomer was all–trans ß–carotene and 9–cis ß–carotene found in our strain. Correspondingly, the maximum values of 9-cis ß-carotene isomer content (27 - 329 mg/g DW) and DPPH scavenging activity (71 - 76%inhibition) were obtained in the experiment for which each nutrient factor has been depleted. The present study suggests that nutrient factors affected to increasing growth, pigment contents and ß-carotene isomer of D. salina NUAC09 and can be used as a guideline for commercial culture. However, the development of cultivation systems for D. salina are still needed to increase cis ß-carotene yields.

Dunaliella เป็นสาหร่ายสีเขียวขนาดเล็กที่มีความสำคัญสำหรับการผลิตสารรงควัตถุเบต้าแคโรทีนซึ่งเป็นสารที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจ และมีคุณสมบัติในการต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพสูง โดยสารกลุ่มนี้ถูกนำไปใช้ทั้งในอุตสาหกรรมที่หลากหลายเช่น ด้านโภชนาการ เภสัชศาสตร์ เครื่องสำอาง และการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ เป็นต้น งานวิจัยนี้มุ่งเน้นเพื่อจัดจำแนกและระบุชนิดสาหร่ายด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยาและอณูชีววิทยา (พื้นที่ยีน 18S rDNA และพื้นที่ยีน ITS) รวมถึงศึกษาปัจจัยการเลี้ยงที่มีผลต่อการเจริญเติบโต ปริมาณรงควัตถุ องค์ประกอบไอโซเมอร์เบต้าแคโรทีน และกิจกรรมการยับยั้งอนุมูลของสาหร่าย D. salina NUAC09 ผลการทดลองพบว่าลักษณะทางสัณฐานวิทยาของสาหร่าย เช่น ขนาด สี ออแกเนลล์ และรูปร่างของเซลล์ มีความใกล้เคียงกับลักษณะทั่วไปของสาหร่ายสกุล Dunaliella เมื่อเปรียบเทียบข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์พบว่ามีค่าความคล้ายคลึงมากกว่าร้อยละ 99 ของพื้นที่ยีน 18S rDNA และร้อยละ 95 ของพื้นที่ยีน ITS สอดคล้องกับผลการวิเคราะห์ความสัมพันธ์การวิวัฒนาการของพื้นที่ยีน ITS ที่แสดงให้เห็นว่าสาหร่าย D. salina NUAC09 อยู่ในกลุ่มเดียวกับ D. salina (ML = 93 % และ NJ = 85 %) ดังนั้นจากลักษณะทางสัณฐานวิทยาและลักษณะทางอณูชีวิทยาจึงจำแนกสาหร่าย NUAC09 เป็น D. salina ในการศึกษาปัจจัยการเลี้ยงที่เหมาะสมในสูตรอาหารดัดแปลง Johnson ได้แก่ ไนโตรเจน (0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00 กรัมของ KNO3 ต่อลิตร) ฟอสฟอรัส (0.000, 0.043, 0.053, 0.070 กรัมของ KH2PO4 ต่อลิตร) ความเค็ม (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 โมลาร์ของ NaCl) และไบคาร์บอเนต (0.00, 0.022, 0.043, 0.065, 0.086 กรัมของ NaHCO3 ต่อลิตร) โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (completely randomized design; CRD) ทำการทดลองเลี้ยงสาหร่ายด้วยถังปฏิกรณ์ชีวภาพชนิดท่อแบบให้แสง (photobioreactor) ระยะเวลาเลี้ยง 14 วัน และตรวจวัดการเจริญเติบโตผลผลิตชีวมวล และปริมาณรงควัตถุ ทุก ๆ 2 วัน นอกจากนี้ตรวจวัดองค์ประกอบและปริมาณไอโซเมอร์ของเบต้าแคโรทีนในสาหร่ายด้วยเทคนิค HPLC ผลของปัจจัยการเลี้ยงพบว่าเมื่อความเข้มข้นของไนโตรเจน ฟอสฟอรัส ความเค็ม และไบคาร์บอเนตเพิ่มขึ้นส่งผลทำให้จำนวนเซลล์ ค่าคลอโรฟิลล์เอ และผลผลิตชีวมวลเพิ่มขึ้นตามไปด้วย ขณะที่แคโรทีนอยด์มีปริมาณเพิ่มขึ้น (p≤0.05) เมื่อปัจจัยธาตุอาหารลดลง อย่างไรก็ตามปัจจัยที่มีความเหมาะสมต่อจำนวนเซลล์ (3.49 - 6.09 เซลล์ต่อมิลลิลิตร) การเจริญเติบโตจำเพาะ (0.57 - 0.82 µ ต่อวัน) และปริมาณคลอโรฟิลล์ เอ (6.46 - 18.43 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) พบในสาหร่ายที่เพาะเลี้ยงในระดับไนโตรเจน 2.00 กรัมของ KNO3 ต่อลิตร ฟอสฟอรัส 0.070 กรัมของ KH2PO4 ต่อลิตร ความเค็ม 2.5 โมลาร์ของ NaCl และไบคาร์บอเนต 0.043 กรัมของ NaHCO3 ต่อลิตร ส่วนองค์ประกอบและปริมาณไอโซเมอร์ของเบต้าแคโรทีนพบไอโซเมอร์ที่เด่นชัดที่สุด คือ all–trans และ 9–cis ß–carotene และมีปริมาณ 9–cis (27 - 329 มิลลิกรัมของน้ำหนักแห้งต่อกรัม) และกิจกรรมการยับยั้งอนุมูลอิสระ (71 - 76%inhibition) สูงสุดในชุดการทดลองที่ขาดธาตุอาหาร ดังนั้นแสดงให้เห็นว่าปัจจัยธาตุอาหารส่งผลต่อการเพิ่มขึ้นของการเจริญเติบโต ปริมาณรงควัตถุ ปริมาณไอโซเมอร์เบต้าแคโรทีน และฤทธิ์การยับยั้งอนุมูลอิสระของสาหร่าย D. salina NUAC09 โดยสามารถนำไปประยุกต์กับการเลี้ยงสาหร่ายสกุล Dunaliella ในระดับเชิงพาณิชย์ แต่อย่างไรก็ตามการพัฒนารูปแบบการเพาะเลี้ยงสาหร่ายยังมีความจำเป็นซึ่งจะช่วยเพิ่มปริมาณผลผลิตซิสเบต้าแคโรทีนให้สูงขึ้นได้